Trapianto di rene ortotopico ratto: un nuovo approccio chirurgico semplificato
Summary
Lo scopo di questo manoscritto e protocollo è quello di spiegare e dimostrare in dettaglio la procedura chirurgica del trapianto di rene ortotopico nei ratti. Questo metodo è semplificato per ottenere la corretta perfusione del rene donatore e abbreviare il tempo di riperfusione utilizzando la tecnica di anastomosi del polsino venoso e ureterale.
Abstract
Il trapianto di rene offre un aumento dei tassi di sopravvivenza e una migliore qualità della vita per i pazienti con malattia renale allo stadio terminale, rispetto a qualsiasi tipo di terapia sostitutiva renale. Nel corso degli ultimi decenni, il modello di trapianto di rene di ratto è stato utilizzato per studiare i fenomeni immunologici di rigetto e tolleranza. Questo modello è diventato uno strumento indispensabile per testare nuovi farmaci e regimi immunomodulatori prima di procedere con costosi studi preclinici su animali di grandi dimensioni.
Questo protocollo fornisce una panoramica dettagliata su come eseguire in modo affidabile il trapianto di rene ortotopico nei ratti. Questo protocollo comprende tre passaggi distintivi che aumentano la probabilità di successo: perfusione del rene donatore da vampate attraverso la vena portale e l’uso di un sistema di polsino per anastomose le vene renali e ureteri, diminuendo così freddo e caldo tempi di ischemia. Utilizzando questa tecnica, abbiamo raggiunto tassi di sopravvivenza oltre i 6 mesi con la normale creatinina sierica negli animali con trapianti renali singenici o tollerante. A seconda dello scopo dello studio, questo modello può essere modificato da trattamenti pre-o post-trapianto per studiare il rigetto acuto, cronico, cellulare o mediato dagli anticorpi. Si tratta di un modello animale riproducibile, affidabile e conveniente per studiare diversi aspetti del trapianto di rene.
Introduction
Storicamente, i primi studi di rigetto del trapianto sono stati eseguiti da Brent e Medawar utilizzando trapianti di pelle nei roditori1. Ben presto divenne chiaro che la pelle ha caratteristiche immunologiche distinte, rendendolo un organo altamente immunogenico che è diverso nel rigetto da altri organi solidi vascolarizzati2. Studi di ratto di rigetto di trapianto di organo solido sono abitualmente limitati a cuore, fegato, e trapianti di rene. Anche se ciascuno di questi organi è adatto a studiare il rigetto, ci sono vantaggi e svantaggi per ciascuno di essi. I trapianti cardiaci sono spesso trapiantati nell’addome e anastomosed all’aorta e alla vena cava, con il cuore nativo del ricevente in posizione3. Questo non ricrea le condizioni cliniche umane, anatomiche e fisiologiche. Inoltre, i cuori sono molto sensibili all’ischemia fredda e devono essere riperfuso preferenzialmente entro 1 h al fine di essere in grado di recuperare la loro funzione4. I trapianti di fegato sono generalmente considerati chirurgicamente più impegnativi e sensibili al tempo per eseguire. Dopo aver rimosso il fegato nativo, il fegato donatore deve essere impiantato e riperfuso entro 30 min come i destinatari non possono durare più a lungo senza un fegato funzionante5. L’arteria epatica, la vena del portale e soprattutto la ricostruzione del dotto biliare richiedono abilità chirurgiche raffinate. Oltre alle sfide chirurgiche, il fegato è noto per possedere proprietà tollerogeniche e roditori e gli esseri umani possono diventare operalmente tolleranti6,7,8. Il rene, a differenza degli organi di cui sopra, può essere trapiantato in modo ortotopico, è noto per essere un organo immunogeno con episodi di rigetto coerenti e riproducibili (se non immunosoppressi), e consente tempi prolungati di ischemia fredda di diversi Ore. Questo rende il trapianto di rene di ratto un modello ideale per studiare il rigetto e la tolleranza dell’alloinnesto.
Il trapianto di rene (KT) è la scelta preferita di trattamento per i pazienti con malattia renale allo stadio terminale. Negli ultimi decenni, i risultati di sopravvivenza a breve termine dopo KT sono migliorati drasticamente, ma i risultati di sopravvivenza a lungo termine sono stagnanti9. I regimi immunosoppressori convenzionali restano la terapia standard anti-rigetto. Tuttavia, l’uso cronico di terapie immunosoppressive provoca morbilità e mortalità significative, come nefrotossicità, diabete e neoplasie secondarie10,11,12. Nel lungo termine, il rigetto cronico di anticorpi e cellulari-mediati minaccia la sopravvivenza del trapianto, con limitate opzioni terapeutiche disponibili.
Un obiettivo importante nel trapianto è l’induzione della tolleranza al trapianto al fine di ovviare alla necessità di immunosoppressione cronica. Il modello di ratto KT è uno strumento robusto per indagare il processo di rigetto immunologico e per valutare nuovi approcci all’immunomodulazione e alla tolleranza al trapianto. Il ratto funge anche da modello adatto per lo studio di rigetto acuto e cronico di cellule e anticorpi mediati13,14,15,16,17. Questo modello chirurgico ha dimostrato di essere uno strumento affidabile, riproducibile e conveniente per studiare vari aspetti del rigetto e della tolleranza dell’alloinnesto. Viene spesso utilizzato per testare nuovi protocolli che inducano la tolleranza prima di intraprendere studi costosi e ingombranti su grandi animali. L’esecuzione di KT in ratti richiede un’ampia formazione chirurgica e competenze per raggiungere tassi di sopravvivenza di > 90%. In questo manoscritto e nel video didattico di accompagnamento, forniamo un contorno passo-passo per il KT ortotopico nel ratto, come eseguito con successo per molti anni presso la nostra istituzione.
Prima di iniziare qualsiasi procedura, la selezione del donatore e del destinatario è critica e dipende dalla natura dell’esperimento. Idealmente, i donatori e i riceventi dovrebbero pesare tra 220 – 260 g ed essere tra 8 – 12 settimane di età. Gli animali sotto 220 g hanno arterie di piccolo diametro, vene e ureteri, rendendo l’anastomosi nel ricevente particolarmente impegnativa. Una minore perdita di sangue può causare ipovolemia e portare alla morte in animali più piccoli. Animali più pesanti di 260 g mostrano più grasso intorno ai loro vasi, e l’isolamento della nave richiederà più tempo operativo e aumentare il tempo di ischemia fredda.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo manoscritto, descriviamo in dettaglio il metodo chirurgico per il KT ortotopico nei ratti, comprese tutte le attrezzature necessarie per eseguire questa procedura (Figura 5). Nel 1965, Fisher e Lee pubblicarono il primo rapporto sul KT in ratti, che divenne l’inizio di un emozionante campo investigativo18. Da allora, sono state introdotte molte modifiche per migliorare la riproducibilità di questo modello. Ha servito come un modello animale efficace per stu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da un generoso dono della tenuta di famiglia Bombeck.
Materials
| Buprenorphine HCL | Reckitt Benckiser Healthcare UK | NDC12496-0757-5 | |
| Dissecting forceps, curved | Zhenbang, China | 11cm Flat handle | |
| Heparin sodium injection USP | Sagent Pharmaceuticals | NDC25021-400-10 | |
| Micro-forceps, straight, smooth | Jingzhong, China | WA3010 | |
| Micro needle holder | Jingzhong, China | WA2010 | |
| Micro vessel clamps | Jingzhong, China | WA40120 | |
| Micro spring sciccor 1 | ROBOZ | RS-5620 | |
| Micro spring sciccor 2 | F.S.T. | 91501-09 | |
| Micro spring sciccor 3 | Zhenbang, China | 8.5cm Vannas,curved | |
| Prograf (Tacrolimus/FK506) | Astellas | ||
| Rats | Charles River & Taconic Biosciences | LEW/Crl & DA-M | |
| Shaver | Wahl | 79600-2101 | |
| Suture 4-0 | Ethicon | J304H | |
| Suture, 4-0 | Ethicon | 683G | |
| Suture, 10-0 | Ethicon | 2820G | |
| Syringes & Needles | BD | ||
| Thread, 8-0 | Ashaway | 75290 | |
| Ureteral cuff | Microlumen | 160-1 | Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm |
| Venous cuff | Intramedic BD | 7441 | PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm |
References
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