Ortotopic rotte nyre transplantation: en roman og forenklet kirurgisk tilgang

Summary

Formålet med dette manuskript og protokol er at forklare og demonstrere i detaljer den kirurgiske procedure af ortotopic nyretransplantation i rotter. Denne metode er forenklet for at opnå den korrekte perfusion af donor nyre og forkorte reperfusion tid ved hjælp af venøs og urinveje manchet anastomose teknik.

Abstract

Nyretransplantation giver øget overlevelsesrater og forbedret livskvalitet for patienter med nyresygdom i slutstadiet, sammenlignet med enhver form for renal substitutionsterapi. I løbet af de sidste par årtier, er rotte nyretransplantation model blevet brugt til at studere de immunologiske fænomener af afvisning og tolerance. Denne model er blevet et uundværligt redskab til at teste nye immunmodulerende lægemidler og regimer forud for at fortsætte med dyre prækliniske store dyreforsøg.

Denne protokol giver en detaljeret oversigt over, hvordan man pålideligt udføre ortotopic nyretransplantation i rotter. Denne protokol indeholder tre karakteristiske trin, der øger sandsynligheden for succes: perfusion af donor nyre ved skylning gennem portalen vene og brugen af et manchet system til anastomose de renale vener og ureters, derved faldende kolde og varme iskæmi gange. Ved hjælp af denne teknik har vi opnået overlevelsesrater ud over 6 måneder med normal serum-kreatinin hos dyr med murinsynogene eller tolerante nyretransplantationer. Afhængigt af undersøgelsens formål kan denne model modificeres ved præ-eller post transplantations behandlinger for at studere akut, kronisk, cellulær eller antistof-medieret afvisning. Det er en reproducerbar, pålidelig og omkostningseffektiv dyremodel til at studere forskellige aspekter af nyretransplantation.

Introduction

Historisk set blev de første transplantations afstødnings undersøgelser udført af Brent og Medawar ved hjælp af hudtransplantationer i gnavere¹. Det blev hurtigt klart, at huden har forskellige immunologiske egenskaber, hvilket gør det til et meget immunogent organ, der er forskelligt i afvisning fra andre vaskulariserede solide organer². Rotteundersøgelser af massiv organtransplantation afvisning er sædvanligvis begrænset til hjerte, lever, og nyretransplantationer. Selv om hver af disse organer er egnet til at studere afvisning, der er fordele og ulemper for hver af dem. Hjertetransplantationer er ofte transplanteret ind i maven og anastomosed til aorta og Vena cava, med modtagerens indfødte hjerte på plads³. Dette genopretter ikke humane kliniske, anatomiske og fysiologiske tilstande. Derudover er hjerter meget følsomme over for kold iskæmi og skal reperfanvendes fortrinsvis inden for 1 time for at være i stand til at inddrive deres funktion⁴. Levertransplantationer er generelt anses for at være kirurgisk mere udfordrende og tidsfølsomme til at udføre. Efter fjernelse af den indfødte lever, donor leveren skal implanteres og reperfanvendes inden for 30 min da modtagerne ikke kan vare længere uden en fungerende leveren⁵. Den hepatiske arterie, portal vene, og især galde kanalen rekonstruktion kræver raffinerede kirurgiske færdigheder. Ud over de kirurgiske udfordringer, leveren er kendt for at besidde tolerogene egenskaber og gnavere og mennesker kan blive operationelt tolerant^6,7,8. Nyrerne, i modsætning til de førnævnte organer, kan transplanteret i en ortotopic mode, er kendt for at være et immunogent organ med konsekvente, reproducerbare afvisning episoder (hvis ikke immun supprimeret), og giver mulighed for langvarig kold iskæmi gange af flere Timer. Dette gør rotte nyretransplantation en ideel model for at studere allograft afvisning og tolerance.

Nyretransplantation (KT) er det foretrukne Behandlingsvalg for patienter med nyresygdom i slutstadiet. I løbet af de sidste par årtier, kortsigtede overlevelse resultater efter KT har forbedret dramatisk, men langsigtede overlevelse resultater er stagnerende⁹. Konventionelle Immunsuppressive regimer forbliver standard anti-afvisning terapi. Kronisk brug af immunosuppressive terapier forårsager imidlertid signifikant sygelighed og dødelighed, såsom nefrotoksicitet, diabetes og sekundære maligniteter^10,11,12. På lang sigt, kronisk antistof-og cellulær-medieret afvisning truer transplantat overlevelse, med begrænsede terapeutiske muligheder til rådighed.

Et vigtigt mål i transplantation er induktion af transplantations tolerance for at undgå behovet for kronisk immunsuppression. Rotte KT-modellen er et robust værktøj til at undersøge den immunologiske afstødnings proces og til at evaluere nye tilgange til immun moduleringen og transplantations tolerancen. Rotten fungerer også som en egnet model til at studere akut og kronisk celle-og antistof-medieret afvisning^{13,14,15,16,17}. Denne kirurgiske model har vist sig at være et pålideligt, reproducerbart og omkostningseffektivt værktøj til at studere forskellige aspekter af allograft afvisning og tolerance. Det er ofte bruges til at teste nye tolerance-inducerende protokoller forud for gennemføre dyre og besværlige store dyreforsøg. Udførelse af KT i rotter kræver omfattende kirurgisk træning og ekspertise for at nå overlevelsesrater på > 90%. I dette manuskript og i den ledsagende instruktionsvideo giver vi en trinvis skitse for ortotopic KT i rotter, som det med succes er udført i mange år på vores institution.

Før påbegyndelse af enhver procedure, donor og modtager udvælgelse er kritisk og afhænger af karakteren af eksperimentet. Ideelt set bør donorer og recipienter veje mellem 220 – 260 g og være mellem 8 – 12 ugers alderen. Dyr under 220 g har arterier med lille diameter, vener og ureters, hvilket gør anastomose i recipienten særlig udfordrende. Mindre blodtab kan forårsage hypovolæmi og føre til døden hos mindre dyr. Dyr tungere end 260 g viser mere fedt omkring deres fartøjer, og fartøjs isolation vil kræve mere operative tid og øge den kolde iskæmi tid.

Protocol

Lewis (RT11) og Dark agouti (da) (RT1Aa) rotter blev købt fra kommercielle leverandører (Se tabellen over materialer). Disse fuldt MHC-mismatchede stammer bruges ofte til at studere akut renal allograft afvisning. Alle dyr blev opstaldet og vedligeholdt i henhold til National Institutes of Health (NIH) retningslinjer i en specifik patogen-fri facilitet på Johns Hopkins University. Alle procedurer blev godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug. <p class="j…

Representative Results

Vi udførte murinsynogene (n = 5) og allogene nyretransplantationer (n = 5). Dyr med en syngen transplantation opnåede langvarig overlevelse uden immunsuppressiv behandling. Dyr, der fik en allogen transplantation uden immunsuppression, afviste deres transplantat og bukkede under for nyresvigt med en Median overlevelse på 8 dage (figur 4a). Det gennemsnitlige serum-kreatinin steg beskedent i den syngeneatiske gruppe, mens det steg med 14 gange i den allog…

Discussion

I dette manuskript beskriver vi den kirurgiske metode for ortotopic KT i rotter i detaljer, herunder alt det nødvendige udstyr, der er nødvendigt for at udføre denne procedure (figur 5). I 1965 udgav Fisher og Lee den første rapport om KT i rotter, som blev starten på et spændende efterforsknings felt¹⁸. Siden da er der blevet indført mange ændringer for at forbedre denne models reproducerbarhed. Det har fungeret som en effektiv dyremodel for at studere iskæm…

Materials

Buprenorphine HCL	Reckitt Benckiser Healthcare UK	NDC12496-0757-5
Dissecting forceps, curved	Zhenbang, China		11cm Flat handle
Heparin sodium injection USP	Sagent Pharmaceuticals	NDC25021-400-10
Micro-forceps, straight, smooth	Jingzhong, China	WA3010
Micro needle holder	Jingzhong, China	WA2010
Micro vessel clamps	Jingzhong, China	WA40120
Micro spring sciccor 1	ROBOZ	RS-5620
Micro spring sciccor 2	F.S.T.	91501-09
Micro spring sciccor 3	Zhenbang, China		8.5cm Vannas,curved
Prograf (Tacrolimus/FK506)	Astellas
Rats	Charles River & Taconic Biosciences	LEW/Crl & DA-M
Shaver	Wahl	79600-2101
Suture 4-0	Ethicon	J304H
Suture, 4-0	Ethicon	683G
Suture, 10-0	Ethicon	2820G
Syringes & Needles	BD
Thread, 8-0	Ashaway	75290
Ureteral cuff	Microlumen	160-1	Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm
Venous cuff	Intramedic BD	7441	PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm