Orthotopic Rat nyre transplantasjon: en roman og forenklet kirurgisk tilnærming

Summary

Formålet med dette manuskriptet og protokollen er å forklare og demonstrere i detalj den kirurgiske prosedyren for orthotopic nyre transplantasjon hos rotter. Denne metoden er forenklet for å oppnå riktig mengde donor nyre og forkorte reperfusion tid ved hjelp av venøs og urinleder cuff anastomose teknikk.

Abstract

Nyre transplantasjon gir økt overlevelse og bedre livskvalitet for pasienter med end-stadium nyresykdom, sammenlignet med alle typer nyre erstatning terapi. I løpet av de siste ti årene har rotte nyre transplantasjon modellen blitt brukt til å studere immunologiske fenomener av avvisning og toleranse. Denne modellen har blitt et uunnværlig verktøy for å teste nye immunmodulerende legemidler og regimer før du fortsetter med dyre prekliniske store dyrestudier.

Denne protokollen gir en detaljert oversikt over hvordan du pålitelig utføre orthotopic nyre transplantasjon hos rotter. Denne protokollen inneholder tre karakteristiske skritt som øker sannsynligheten for å lykkes: å gjennomføre donor nyre ved å skylle gjennom portalen vene og bruk av et mansjett-system for å anastomose nyre årer og urinlederne, og dermed redusere kulde og varme iskemi ganger. Ved hjelp av denne teknikken, har vi oppnådd overlevelse utover 6 måneder med normal serum kreatinin i dyr med syngeneic eller tolerant nyre transplantasjon. Avhengig av formålet med studien, kan denne modellen endres ved pre-eller posttransplant behandlinger for å studere akutte, kroniske, cellulære eller antistoff-mediert avvisning. Det er en reproduserbar, pålitelig og kostnadseffektiv dyremodell for å studere ulike aspekter ved nyre transplantasjon.

Introduction

Historisk ble den første transplantasjon avvisning studier utført av brent og Medawar bruker hud transplantasjon i gnagere¹. Det ble snart klart at huden har distinkte immunologiske funksjoner, noe som gjør det til et svært immunogenic organ som er forskjellig i avvisning fra andre vascularized solide organer². Rat studier av solid organ transplantasjon avvisning er fast begrenset til hjerte, lever og nyre transplantasjon. Selv om hver av disse organene er egnet til å studere avvisning, det er fordeler og ulemper til hver av dem. Hjertet transplantasjon er ofte transplantert inn i magen og endetarms til aorta og vena cava, med mottakerens eget hjerte på plass³. Dette betyr ikke gjenskape menneskelige kliniske, anatomiske og fysiologiske forhold. I tillegg hjerter er svært følsomme for kaldt iskemi og må reperfused fortrinnsvis innen 1 time for å kunne gjenopprette sin funksjon⁴. Leveren transplantasjon er generelt ansett for å være kirurgisk mer utfordrende og tid-følsom å utføre. Etter å ha fjernet den innfødte leveren, donor leveren må implantert og reperfused innen 30 min som mottakerne ikke kan vare lenger uten en fungerende lever⁵. Hepatic arterien, Portal vene, og spesielt galle duct gjenoppbygging krever raffinert kirurgiske ferdigheter. I tillegg til kirurgiske utfordringer, leveren er kjent for å ha tolerogenic egenskaper og gnagere og mennesker kan bli operativt tolerant^6,7,8. Nyrene, i motsetning til de nevnte organene, kan være transplantert i en orthotopic mote, er kjent for å være en immunogenic organ med konsistent, reproduserbar avvisning episoder (hvis ikke aper), og gir mulighet for langvarig kalde iskemi tider av flere Timer. Dette gjør rotte nyrene transplantasjon en ideell modell for å studere allograft avvisning og toleranse.

Nyre transplantasjon (KT) er det foretrukne valget av behandling for pasienter med end-Stage nyresykdom. I løpet av de siste ti årene, kortsiktige overlevelse utfall etter KT har bedret seg dramatisk, men langsiktige overlevelse utfall er stillestående⁹. Konvensjonelle immunsuppressiv regimer forblir standard anti-avvisning terapi. Men kronisk bruk av immunsuppressiv terapier forårsaker betydelig sykelighet og dødelighet, slik som nefrotoksisitet, diabetes, og sekundær ondartet^10,11,12. På lang sikt, kronisk antistoff-og cellulær-mediert avvisning truer pode overlevelse, med begrensede terapeutiske alternativer tilgjengelig.

Et viktig mål i transplantasjon er induksjon av transplantasjon toleranse for å obviate behovet for kroniske immunsuppresjon. The Rat KT-modellen er et robust verktøy for å undersøke immunologiske avvisning prosessen og for å evaluere nye tilnærminger til immunomodulation og transplantasjon toleranse. Rotta fungerer også som en passende modell for å studere akutt og kronisk celle-og antistoff-mediert avvisning^{13, 14,15,16,17}. Denne kirurgiske modellen har vist seg å være en pålitelig, reproduserbar og kostnadseffektiv verktøy for å studere ulike aspekter ved allograft avvisning og toleranse. Det er ofte brukt til å teste romanen toleranse-inducing protokoller før foretaket dyre og tungvint store dyr studier. Utføre KT i rotter krever omfattende kirurgisk trening og ekspertise for å nå overlevelse på > 90%. I dette manuskriptet og i den med følgende instruksjonsvideoen, gir vi en trinnvis oversikt for orthotopic KT i rotte, som vellykket utført i mange år på vår institusjon.

Før du starter en prosedyre, er donor-og mottaker valg kritisk og avhenger av typen eksperiment. Ideelt sett bør donorer og mottakere veie mellom 220 – 260 g og være mellom 8 – 12 ukers alder. Dyr under 220 g har liten diameter arterier, årer, og urinlederne, noe som gjør anastomose i mottakeren spesielt utfordrende. Mindre blodtap kan forårsake hypovolemi og føre til død i mindre dyr. Dyr tyngre enn 260 g vise mer fett rundt sine fartøy, og fartøyet isolasjon vil kreve mer operative tid og øke kulden iskemi tid.

Protocol

Lewis (RT11) og Dark AGOUTI (da) (RT1Aa) rotter ble kjøpt fra kommersielle leverandører (se tabellen over materialer). Disse fullt MHC-feilaktige stammer blir ofte brukt til å studere akutt renal allograft avvisning. Alle dyrene ble plassert og vedlikeholdt i henhold til National Institutes of Health ‘ s (NIH) retningslinjer i en bestemt patogen-fritt anlegg ved Johns Hopkins University. Alle prosedyrer ble godkjent av den institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteen. <p class…

Representative Results

Vi utførte syngeneic (n = 5) og allogene nyre transplantasjon (n = 5). Dyr med en syngeneic transplantasjon oppnådde lang tids overlevelse uten noen immunsuppressiv behandling. Dyr som fikk en allogene transplantasjon uten immunsuppresjon avviste sin pode og bukket under for nyresvikt med en median overlevelse på 8 dager (Figur 4a). Gjennomsnittlig serum kreatinin økt beskjedent i syngeneic gruppen mens den økte med 14-fold i allogene gruppen (0,5 mg/d…

Discussion

I dette manuskriptet beskriver vi den kirurgiske metoden for orthotopic KT i rotter i detalj, inkludert alt nødvendig utstyr som trengs for å utføre denne prosedyren (figur 5). I 1965 publiserte Fisher og Lee den første rapporten om KT-rotter, som ble starten på et spennende undersøkende felt¹⁸. Siden da har det blitt innført mange endringer for å forbedre reproduserbarheten til denne modellen. Det har fungert som en effektiv dyremodell for å studere iskemi-r…

Materials

Buprenorphine HCL	Reckitt Benckiser Healthcare UK	NDC12496-0757-5
Dissecting forceps, curved	Zhenbang, China		11cm Flat handle
Heparin sodium injection USP	Sagent Pharmaceuticals	NDC25021-400-10
Micro-forceps, straight, smooth	Jingzhong, China	WA3010
Micro needle holder	Jingzhong, China	WA2010
Micro vessel clamps	Jingzhong, China	WA40120
Micro spring sciccor 1	ROBOZ	RS-5620
Micro spring sciccor 2	F.S.T.	91501-09
Micro spring sciccor 3	Zhenbang, China		8.5cm Vannas,curved
Prograf (Tacrolimus/FK506)	Astellas
Rats	Charles River & Taconic Biosciences	LEW/Crl & DA-M
Shaver	Wahl	79600-2101
Suture 4-0	Ethicon	J304H
Suture, 4-0	Ethicon	683G
Suture, 10-0	Ethicon	2820G
Syringes & Needles	BD
Thread, 8-0	Ashaway	75290
Ureteral cuff	Microlumen	160-1	Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm
Venous cuff	Intramedic BD	7441	PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm