Trasplante de riñón de rata ortotópica: un enfoque quirúrgico novedoso y simplificado
Summary
El propósito de este manuscrito y el protocolo es explicar y demostrar en detalle el procedimiento quirúrgico de trasplante ortotópico de riñón en ratas. Este método se simplifica para lograr la correcta perfusión del riñón del donante y acortar el tiempo de reperfusión mediante el uso de la técnica de anastomosis del manguito venoso y ureteral.
Abstract
El trasplante de riñón ofrece mayores tasas de supervivencia y una mejor calidad de vida para los pacientes con enfermedad renal terminal, en comparación con cualquier tipo de terapia de reemplazo renal. En las últimas décadas, el modelo de trasplante de riñón de rata se ha utilizado para estudiar los fenómenos inmunológicos de rechazo y tolerancia. Este modelo se ha convertido en una herramienta indispensable para probar nuevos fármacos inmunomoduladores y regímenes antes de proceder con costosos estudios preclínicos de animales grandes.
Este protocolo proporciona una descripción detallada de cómo realizar de forma fiable el trasplante de riñón ortotópico en ratas. Este protocolo incluye tres pasos distintivos que aumentan la probabilidad de éxito: la perfusión del riñón del donante mediante el lavado a través de la vena porta y el uso de un sistema de manguito para anastomozar las venas renales y los uréteres, disminuyendo así el frío y el calor tiempos de isquemia. Usando esta técnica, hemos logrado tasas de supervivencia más allá de 6 meses con creatinina sérica normal en animales con trasplantes de riñón singénicos o tolerantes. Según el objetivo del estudio, este modelo puede modificarse mediante tratamientos previos o posteriores al trasplante para estudiar el rechazo agudo, crónico, celular o mediado por anticuerpos. Es un modelo animal reproducible, fiable y rentable para estudiar diferentes aspectos del trasplante de riñón.
Introduction
Históricamente, los primeros estudios de rechazo de trasplantes fueron realizados por Brent y Medawar usando trasplantes de piel en roedores1. Pronto se hizo evidente que la piel tiene rasgos inmunológicos distintos, por lo que es un órgano altamente inmunogénico que es diferente en el rechazo de otros órganos sólidos vascularizados2. Los estudios de rata sobre el rechazo del trasplante de órganos sólidos se limitan habitualmente a los trasplantes de corazón, hígado y riñón. Aunque cada uno de estos órganos es adecuado para estudiar el rechazo, hay ventajas y desventajas para cada uno de ellos. Los trasplantes de corazón a menudo se trasplantan en el abdomen y se anastomizadas a la aorta y la vena cava, con el corazón nativo del receptor en el lugar3. Esto no recrea las condiciones clínicas, anatómicas y fisiológicas humanas. Además, los corazones son muy sensibles a la isquemia fría y tienen que ser reperfusionados preferentemente dentro de 1 h con el fin de poder recuperar su función4. Los trasplantes de hígado se consideran generalmente para ser quirúrgicamente más desafiantes y sensibles al tiempo para realizar. Después de extirpar el hígado nativo, el hígado del donante tiene que ser implantado y reperfusionado dentro de 30 minutos, ya que los receptores no pueden durar más tiempo sin un funcionamiento del hígado5. La arteria hepática, la vena porta, y especialmente la reconstrucción del conducto biliar requiere habilidades quirúrgicas refinadas. Además de los desafíos quirúrgicos, el hígado es conocido por poseer propiedades tolerogénicas y los roedores y los seres humanos pueden llegar a ser operativamente tolerantes6,7,8. El riñón, a diferencia de los órganos antes mencionados, puede ser trasplantado de forma ortotópica, se sabe que es un órgano inmunogénico con episodios de rechazo consistentes y reproducibles (si no inmunosuprimidos), y permite la isquemia prolongada en frío de varios Horas. Esto hace que el trasplante de riñón de rata sea un modelo ideal para estudiar el rechazo de aloinjertos y la tolerancia.
El trasplante de riñón (KT) es la elección preferida de tratamiento para pacientes con enfermedad renal terminal. En las últimas décadas, los resultados de supervivencia a corto plazo después de KT han mejorado drásticamente, pero los resultados de supervivencia a largo plazo están estancado9. Los regímenes inmunosupresores convencionales siguen siendo la terapia antirechazo estándar. Sin embargo, el uso crónico de terapias inmunosupresoras provoca una morbilidad y mortalidad significativas, como nefrotoxicidad, diabetes y tumores malignos secundarios10,11,12. A largo plazo, el rechazo crónico de anticuerpos y mediado por celulares amenaza la supervivencia del injerto, con opciones terapéuticas limitadas disponibles.
Un objetivo importante en el trasplante es la inducción de la tolerancia al trasplante con el fin de obviar la necesidad de inmunosupresión crónica. El modelo KT de rata es una herramienta robusta para investigar el proceso de rechazo inmunológico y evaluar nuevos enfoques para la inmunomodulación y la tolerancia al trasplante. La rata también sirve como un modelo adecuado para estudiar el rechazo agudo y crónico mediado por células y anticuerpos13,14,15,16,17. Este modelo quirúrgico ha demostrado ser una herramienta fiable, reproducible y rentable para estudiar diversos aspectos del rechazo y la tolerancia a los aloinjertos. A menudo se utiliza para probar nuevos protocolos inductores de tolerancia antes de emprender estudios costosos y engorrosos de animales grandes. La realización de KT en ratas requiere una amplia formación quirúrgica y experiencia para alcanzar tasas de supervivencia de > 90%. En este manuscrito y en el video instructivo que acompaña, proporcionamos un esquema paso a paso para el ortotópico KT en la rata, como se realizó con éxito durante muchos años en nuestra institución.
Antes de iniciar cualquier procedimiento, la selección de donantes y receptores es fundamental y depende de la naturaleza del experimento. Idealmente, los donantes y los beneficiarios deben pesar entre 220 – 260 g y tener entre 8 – 12 semanas de edad. Los animales de menos de 220 g tienen arterias, venas y uréteres de diámetro pequeño, lo que hace que la anastomosis en el recipiente sea particularmente desafiante. La pérdida de sangre leve puede causar hipovolemia y provocar la muerte en animales más pequeños. Los animales más pesados que 260 g muestran más grasa alrededor de sus vasos, y el aislamiento del recipiente requerirá más tiempo operativo y aumentar el tiempo de isquemia fría.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este manuscrito, describimos el método quirúrgico para el ortotópico KT en ratas en detalle, incluyendo todo el equipo necesario para llevar a cabo este procedimiento (figura 5). En 1965, Fisher y Lee publicaron el primer informe sobre KT en ratas, que se convirtió en el inicio de un emocionante campo de investigación18. Desde entonces, se han introducido muchas modificaciones para mejorar la reproducibilidad de este modelo. Ha servido como un modelo animal ef…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por un generoso regalo de Bombeck Family Estate.
Materials
| Buprenorphine HCL | Reckitt Benckiser Healthcare UK | NDC12496-0757-5 | |
| Dissecting forceps, curved | Zhenbang, China | 11cm Flat handle | |
| Heparin sodium injection USP | Sagent Pharmaceuticals | NDC25021-400-10 | |
| Micro-forceps, straight, smooth | Jingzhong, China | WA3010 | |
| Micro needle holder | Jingzhong, China | WA2010 | |
| Micro vessel clamps | Jingzhong, China | WA40120 | |
| Micro spring sciccor 1 | ROBOZ | RS-5620 | |
| Micro spring sciccor 2 | F.S.T. | 91501-09 | |
| Micro spring sciccor 3 | Zhenbang, China | 8.5cm Vannas,curved | |
| Prograf (Tacrolimus/FK506) | Astellas | ||
| Rats | Charles River & Taconic Biosciences | LEW/Crl & DA-M | |
| Shaver | Wahl | 79600-2101 | |
| Suture 4-0 | Ethicon | J304H | |
| Suture, 4-0 | Ethicon | 683G | |
| Suture, 10-0 | Ethicon | 2820G | |
| Syringes & Needles | BD | ||
| Thread, 8-0 | Ashaway | 75290 | |
| Ureteral cuff | Microlumen | 160-1 | Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm |
| Venous cuff | Intramedic BD | 7441 | PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm |
References
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