Технология CRISPR/Cas9 в восстановлении экспрессии дистрофинов в iPSC-производных мышечных прародителях
Summary
Здесь мы представляем протокол удаления Exon23 на основе Cas9 для восстановления экспрессии дистрофина в iPSC из фибробластов кожи, полученных из мышиDmdx, полученных от мыши, и непосредственно дифференцировать iPSCs в миогенные клетки-предродители (MPC) с помощью системы активации Tet-on MyoD.
Abstract
Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) является тяжелым прогрессирующим заболеванием мышц, вызванным мутациями в гене дистрофина, что в конечном итоге приводит к истощению клеток-прародителей мышц. Кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторы / CRISPR-ассоциированных 9 (CRISPR/ Cas9) редактирование генов имеет потенциал для восстановления экспрессии гена дистрофина. Автологические индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) полученных мышечных клеток-прародителей (MPC) может пополнить стволовых / прародителей клеток бассейн, ремонт повреждений, и предотвратить дальнейшие осложнения в DMD, не вызывая иммунного ответа. В этом исследовании мы представляем сочетание CRISPR/Cas9 и неинтегрированных технологий iPSC для получения мышечных прародителей с восстановленным выражением белка дистрофина. Вкратце, мы используем неинтегрируя вектор Sendai для того чтобы установить линию iPSC от дермальных fibroblasts мышейMdx Dmd. Затем мы используем стратегию удаления CRISPR/Cas9 для восстановления экспрессии дисстрофинов через негомологический конец соединения рерамбированный ген дистрофина. После проверки PCR exon23 истощения в трех колониях из 94 выбрали iPSC колоний, мы дифференцировать iPSC в MPC по доксициклин (Dox) индуцированной выражение MyoD, ключевой фактор транскрипции играет значительную роль в регулировании дифференциации мышц. Наши результаты показывают возможность использования стратегии удаления CRISPR/Cas9 для восстановления экспрессии дистрофина в IPC-производных MPC, который имеет значительный потенциал для разработки будущих методов лечения DMD.
Introduction
Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) является одной из наиболее распространенных мышечных дистрофий и характеризуется отсутствием дистрофина, затрагивающих 1 из примерно 5000 новорожденных мальчиков во всем мире1. Потеря функции гена дистрофина приводит к структурным мышечным дефектам, приводяк к прогрессирующей дегенерации миофиберд1,2. Рекомбинантный адено-ассоциированный вирус (rAAV)-опосредованная система генной терапии была протестирована для восстановления экспрессии дистрофина и улучшения функции мышц, таких как замена генов с помощью микро-дистрофинов (з-Дис). Тем не менее, подход rAAV требует повторных инъекций для поддержания экспрессии функционального белка3,4. Поэтому нам нужна стратегия, которая может обеспечить эффективное и постоянное восстановление экспрессии генов дистрофинов у пациентов с DMD. Мышь Dmdmdx, модель мыши для DMD, имеет мутацию точки в экзоне 23 гена дистрофина, который вводит преждевременное прекращение кодона и приводит к нефункциональному усеченного белка, не имеющего C-терминального дистрогликанового связующего домена. Недавние исследования показали использование технологии CRISPR/Cas9 для восстановления экспрессии генов дистрофина путем точной коррекции генов или удаления мутантов экзона у малых и крупных животных5,6,7. Long et al.8 сообщили о методе коррекции мутации гена дистрофинов в зародыше мыши Dmdmdx с помощью гомологического ремонта (HDR) на основе редактирования генома CRISPR/Cas9. El Refaey et al.9 сообщили, что RAAV может эффективно акцизного мутанта экзона 23 у дистрофических мышей. В этих исследованиях, gRNAs были разработаны в интронах 20 и 23, чтобы вызвать двухцепочечные разрывы ДНК, которые частично восстановили экспрессию дистрофина после восстановления ДНК через негомологический конец соединения (NHEJ). Еще более захватывающим, Amoasii et al.10 недавно сообщили об эффективности и осуществимости редактирования генов rAAV CRISPR в восстановлении экспрессии дистрофина в собачьих моделях, что является важным шагом в будущем клиническом применении.
DMD также вызывает нарушения стволовых клеток11. Для повреждения мышц, жилые стволовые клетки мышц пополнить умирающих мышечных клеток после дифференциации мышц. Однако последовательные циклы травм и ремонта приводят к сокращению теломер в мышечных стволовых клетках12,а преждевременное истощение пулов стволовых клеток13,14. Таким образом, сочетание аутологичной терапии стволовыми клетками с редактированием генома для восстановления экспрессии дистрофина может быть практическим подходом для лечения ДМД. Технология CRISPR/Cas9 предоставляет возможность генерации аутологичной генетически исправленной пурипотентной пурипотентной реакции (iPSC) для функциональной регенерации мышц и предотвращения дальнейших осложнений DMD, не вызывая иммунного отторжения. Тем не менее, iPSCs имеют риск образования опухоли, которые могут быть смягчены дифференциации iPSC в миогенных клеток-прародителей.
В этом протоколе мы описываем использование неинтегрирующего вируса Сендай для перепрограммирования дермальных фибробластов мышей Dmdmdx в iPSCs, а затем восстановления экспрессии дистрофина путем удаления генома CRISPR/Cas9. После проверки удаления Exon23 в iPSC путем генотипирования, мы дифференцировали геном-исправлено iPSC в миогенных прародителей (MPC) через MyoD-индуцированной миогенной дифференциации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) является разрушительным и в конечном итоге смертельным наследственным заболеванием, характеризующимся отсутствием дистрофии, что приводит к прогрессирующей атрофии мышц1,2. Наши результаты демонстрируют восстановленную …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Тан и Вайнтрауб были частично поддержаны NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
Materials
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 | |
References
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
- Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
- Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
- Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
- Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
- Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
- Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
- Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
- Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
- Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244 (2015).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).
