Tecnologia CRISPR/Cas9 na restauração da expressão de distrofina em progenitores musculares derivados de iPSC
Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo de apagamento exon23 baseado em Cas9 para restaurar a expressão de distrofina em iPSC de fibroblastos de pele derivados do mouseMDX DMD e diferenciar diretamente iPSCs em células progenitoras miogênicas (MPC) usando o sistema de ativação Tet-on MyoD.
Abstract
A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença progressiva severa do músculo causada por mutações no gene da distrofina, que conduz finalmente ao esgotamento de pilhas do progenitor do músculo. Agrupadas regularmente interespaçadas repetições palindromic curtas/CRISPR-Associated 9 (CRISPR/Cas9) edição de gene tem o potencial para restaurar a expressão do gene distrofina. As pilhas de haste pluripotentes induzidas autólogas (iPSCs)-células progenitoras derivadas do músculo (MPC) podem reabastecer a associação da pilha da haste/progenitor, reparar dano, e impedir umas complicações mais adicionais no DMD sem causar uma resposta imune. Neste estudo, nós introduzimos uma combinação de CRISPR/Cas9 e de tecnologias não-integradas de iPSC para obter progenitores do músculo com expressão recuperada da proteína do distrophin. Resumidamente, utilizamos um vetor de Sendai não integradora para estabelecer uma linha de iPSC a partir de fibroblastos dérmicos de camundongos DMDMDX . Nós usamos então a estratégia do apagamento de CRISPR/Cas9 para restaurar a expressão do distrophin através de uma junção não-homóloga da extremidade do gene reframed da distrofina. Depois que a validação do PCR da prostração exon23 em três colônias de 94 escolheu colônias de IPSC, nós diferenciamos IPSC em MPC pela expressão doxiciclina (Dox)-induzida de MyoD, um fator chave da transcrição que joga um papel significativo em regular a diferenciação do músculo. Nossos resultados demonstram a viabilidade do uso da estratégia de deleção CRISPR/Cas9 para restaurar a expressão de distrofina no MPC derivado do iPSC, que tem um potencial significativo para o desenvolvimento de terapias futuras para o tratamento da DMD.
Introduction
A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma das distrofias musculares mais comuns e é caracterizada pela ausência de distrofina, afetando 1 de aproximadamente 5.000 meninos recém-nascidos no mundo inteiro1. A perda da função do gene da distrofina resulta em defeitos estruturais do músculo que conduzem à degeneração progressiva do myofibers1,2. O vírus adeno-associado recombinante (rAAV)-o sistema mediado da terapia de gene foi testado para restaurar a expressão do distrophin e para melhorar a função do músculo, tal como a recolocação do gene usando micro-distrophins (μ-DYS). No entanto, a abordagem Raav requer injeções repetidas para sustentar a expressão da proteína funcional3,4. Conseqüentemente, nós precisamos uma estratégia que possa fornecer eficazmente e permanentemente a expressão de gene da distrofina da recuperação nos pacientes com DMD. O DMDMDX mouse, um modelo de mouse para DMD, tem uma mutação de ponto no exon 23 do gene distrofina que introduz um Codon terminação prematura e resulta em uma proteína não-funcional truncado faltando o domínio de ligação C-terminal distroglicanos. Estudos recentes demonstraram o uso da tecnologia crispr/Cas9 para restaurar a expressão gênica de distrofina por correção genética exata ou deleção do exon mutante em animais pequenos e grandes5,6,7. Long et al.8 relataram o método para corrigir a mutação genética da distrofina na germline de DMDMDX mouse por meio da edição do genoma de crispr/Cas9 com base na reparação dirigida por homologia (HDR). El Refaey et al.9 relataram que a Raav poderia, com eficiência, Exir o mutante 23 em camundongos distróficos. Nestes estudos, os grnas foram projetados nos íntrons 20 e 23 para causar rupturas dobro-encalhadas do ADN, que restaurou parcialmente a expressão do distrophin após o reparo do ADN através da junção não-homóloga da extremidade (nhej). Ainda mais excitante, Amoasii et al.10 relataram recentemente a eficácia e a viabilidade da edição do gene crispr mediado pela Raav na restauração da expressão de distrofina em modelos caninos, um passo essencial na futura aplicação clínica.
DMD também provoca distúrbios da célula-tronco11. Para danos musculares, células-tronco musculares residenciais reabastecem células musculares morrendo após a diferenciação muscular. No entanto, os ciclos consecutivos de lesão e reparo levam ao encurtamento dos telômeros nas células-tronco musculares12e depleção prematura de pools de células-tronco13,14. Conseqüentemente, uma combinação de terapia autóloga da pilha de haste com edição do genoma para restaurar a expressão do distrophin pode ser uma aproximação prática para tratar DMD. A tecnologia CRISPR/Cas9 fornece a possibilidade de gerar células-tronco pluripotentes induzidas geneticamente autólogas (iPSC) para a regeneração muscular funcional e evitar complicações adicionais da DMD sem causar rejeição imune. Entretanto, os iPSCs têm um risco da formação do tumor, que poderia ser aliviado pela diferenciação de iPSC em pilhas myogenic do progenitor.
Neste protocolo, nós descrevemos o uso do vírus de Sendai não-integrando a reprogramação fibroblasto dérmicos de ratosMDX de DMD em iPSCs e recuperamos então a expressão do distrophin pelo apagamento do genoma de crispr/Cas9. Após a validação do apagamento Exon23 em iPSC pela genotipagem, nós diferenciamos o iPSC genoma-corrigido em progenitores myogenic (MPC) através da diferenciação myogenic MyoD-induzida.
Protocol
Representative Results
Discussion
A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença hereditária destrutiva e finalmente fatal caracterizada pela falta de distrofina, levando à atrofia progressiva do músculo1,2. Nossos resultados demonstram a expressão restaurada do gene do distrophin em pilhas de progenitor myogenic de DMDMDX IPSC-derivadas pela aproximação do apagamento EXON23 de crispr/Cas9-negociado. Esta abordagem tem três vantagens.
Primeiram…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tang e Weintraub foram parcialmente apoiados por NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
Materials
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 | |
References
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