Tecnología CRISPR/Cas9 en la restauración de la expresión de distrofina en progenitores musculares derivados de iPSC
Summary
Aquí, presentamos un protocolo de eliminación exon23 basado en Cas9 para restaurar la expresión de distrofina en iPSC a partir de fibroblastos cutáneos derivados del ratón Dmdmdx y diferenciar directamente los iPSC en células progenitoras miogénicas (MPC) utilizando el sistema de activación Tet-on MyoD.
Abstract
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad muscular progresiva grave causada por mutaciones en el gen de la distrofina, que en última instancia conduce al agotamiento de las células progenitoras musculares. La edición de genes 9 (CRISPR/Cas9) agrupada regularmente interespaciada tiene el potencial de restaurar la expresión del gen de la distrofina. Las células progenitoras musculares derivadas de células madre (iPSC) derivadas de células anticuarias derivadas de la ínloga (IPSC) pueden reponer la agrupación de células madre/progenitoras, reparar el daño y prevenir más complicaciones en dMD sin causar una respuesta inmunitaria. En este estudio, introducimos una combinación de tecnologías CRISPR/Cas9 y iPSC no integradas para obtener progenitores musculares con expresión de proteína de distrofina recuperada. Brevemente, utilizamos un vector Sendai no integrador para establecer una línea iPSC a partir de fibroblastos dérmicos de ratones Dmdmdx. A continuación, utilizamos la estrategia de eliminación de CRISPR/Cas9 para restaurar la expresión de la distrofina a través de una unión final no homóloga del gen de la distrofina reenmarcada. Después de la validación de PCR de agotamiento de exon23 en tres colonias de 94 colonias iPSC escogidas, diferenciamos iPSC en MPC por expresión de MyoD inducida por doxiciclina (Dox), un factor de transcripción clave que desempeña un papel significativo en la regulación de la diferenciación muscular. Nuestros resultados muestran la viabilidad de utilizar la estrategia de eliminación de CRISPR/Cas9 para restaurar la expresión de distrofina en MPC derivado de iPSC, que tiene un potencial significativo para desarrollar terapias futuras para el tratamiento de la DMD.
Introduction
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una de las distrofias musculares más comunes y se caracteriza por la ausencia de distrofina, afectando a 1 de aproximadamente 5.000 niños recién nacidos en todo el mundo1. La pérdida de la función del gen de la distrofina da lugar a defectos musculares estructurales que conducen a la degeneración progresiva de las miofibras1,2. Se ha probado el sistema de terapia génica mediado por el virus adeno asociado recombinante (rAAV) para restaurar la expresión de la distrofina y mejorar la función muscular, como el reemplazo de genes mediante microdistrophins(-Dys). Sin embargo, el enfoque de rAAV requiere inyecciones repetidas para sostener la expresión de la proteína funcional3,4. Por lo tanto, necesitamos una estrategia que pueda proporcionar de manera efectiva y permanente la expresión génica de la distrofina en pacientes con DMD. El ratón Dmdmdx, un modelo de ratón para DMD, tiene una mutación puntual en el exón 23 del gen de la distrofina que introduce un codón de terminación prematura y da como resultado una proteína truncada no funcional que carece del dominio de unión de distroglicano C-terminal. Estudios recientes demostraron el uso de la tecnología CRISPR/Cas9 para restaurar la expresión del gen de la distrofina mediante una corrección génica precisa o la eliminación de exón mutante en animales pequeños y grandes5,6,7. 8 informaron del método para corregir la mutación del gen de la distrofina en la línea germinal del ratón Dmdmdx por reparación dirigida por homología (HDR) basada en la edición del genoma CRISPR/Cas9. 9informaron que el rAAV podría extirpar eficientemente el exón 23 mutante en ratones distróficos. En estos estudios, los gRNA fueron diseñados en los intrones 20 y 23 para causar roturas de ADN de doble cadena, que restauraron parcialmente la expresión de distrofina después de la reparación del ADN a través de la unión final no homóloga (NHEJ). 10 recientemente informaron de la eficacia y viabilidad de la edición de genes CRISPR mediada por rAAV en la restauración de la expresión de distrofina en modelos caninos, un paso esencial en la aplicación clínica futura.
DMD también causa trastornos de las células madre11. Para el daño muscular, las células madre musculares residenciales reponen las células musculares moribundas después de la diferenciación muscular. Sin embargo, los ciclos consecutivos de lesión y reparación conducen a la acortación de telómeros en las células madre musculares12,y el agotamiento prematuro de las agrupaciones de células madre13,14. Por lo tanto, una combinación de terapia de células madre autóloga con edición del genoma para restaurar la expresión de la distrofina puede ser un enfoque práctico para el tratamiento de la DMD. La tecnología CRISPR/Cas9 ofrece la posibilidad de generar células madre pluripotentes inducidas genéticamente autodescriptivas (iPSC) para la regeneración muscular funcional y prevenir más complicaciones de DMD sin causar rechazo inmune. Sin embargo, los ISPC tienen un riesgo de formación de tumores, que podría aliviarse mediante la diferenciación de iPSC en células progenitoras miogénicas.
En este protocolo, describimos el uso del virus Sendai no integrador para reprogramar fibroblastos dérmicos de ratones Dmdmdx en isPC y luego recuperar la expresión de distrofina mediante la eliminación del genoma CRISPR/Cas9. Después de la validación de la eliminación de Exon23 en iPSC por genotipado, diferencimos el iPSC corregido por genoma en progenitores miogénicos (MPC) a través de la diferenciación miogénica inducida por MyoD.
Protocol
Representative Results
Discussion
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad hereditaria destructiva y, en última instancia, mortal caracterizada por la falta de distrofina, lo que conduce a la atrofia muscular progresiva1,2. Nuestros resultados demuestran la expresión del gen de la distrofina restaurada en las células progenitoras miogénicas derivadas de Dmdmdx iPSC mediante el enfoque de la eliminación del exón23 mediado por CRISPR/Cas9. Este enfoque tiene tres v…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tang y Weintraub fueron parcialmente compatibles con NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
Materials
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 | |
References
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