iPSC由来筋前駆体におけるジストロフィン発現の回復に関するCRISPR/Cas9技術
Summary
ここでは、Dmdmdxマウス由来皮膚線維芽細胞からiPSC中のジストロフィン発現を復元し、Tet-on MyoD活性化システムを用いてiPSCを筋原性前駆細胞(MPC)に直接分化させるCas9ベースのexon23欠失プロトコルを提示する。
Abstract
デュシェンヌ筋ジストロフィー(DMD)は、ジストロフィン遺伝子の突然変異によって引き起こされる重度の進行性筋疾患であり、最終的には筋前駆細胞の枯渇につながる。クラスター化された定期的に間隔をあけた短いパリドロミックリピート/CRISPR関連9(CRISPR/Cas9)遺伝子編集は、ジストロフィン遺伝子の発現を回復させる可能性を有する。自家誘導多能性幹細胞(iPSC)由来の筋肉前駆細胞(MPC)は、幹/前駆細胞プールを補充し、損傷を修復し、免疫応答を引き起こさずにDMDのさらなる合併症を防ぐことができます。本研究では、CRISPR/Cas9と非統合iPSC技術を組み合わせて、回復したジストロフィンタンパク質発現を持つ筋肉前駆体を得ることを紹介する。簡単に言えば、非積分センダイベクターを用いて、Dmdmdxマウスの真皮線維芽細胞からiPSCラインを確立する。次に、CRISPR/Cas9欠失戦略を使用して、再フレームされたジストロフィン遺伝子の非相同末結合を通じてジストロフィン発現を回復させます。94個のピックiPSCコロニーから3つのコロニーにおけるexon23枯渇のPCR検証後、筋分化の調節に重要な役割を果たす重要な転写因子であるMoDのドキシサイクリン(Dox)誘導発現により、iPSCをMPCに分化する。我々の結果は、DMD治療のための将来の治療法を開発する上で大きな可能性を有するiPSC由来MPCにおけるジストロフィン発現を回復させるためにCRISPR/Cas9欠失戦略を用いることを可能にすることを示した。
Introduction
デュシェンヌ筋ジストロフィー(DMD)は、最も一般的な筋ジストロフィーの一つであり、ジストロフィンの不在によって特徴付けられており、世界中の約5,000人の新生児の1人に影響を与える。ジストロフィン遺伝子機能の喪失は、進行性筋線維変性1、2につながる構造的な筋肉欠損をもたらす。組換えアデノ関連ウイルス(rAAV)媒介遺伝子治療システムは、ジストロフィン発現を回復させ、マイクロジストロフィン(μ-Dys)を用いて遺伝子置換などの筋肉機能を改善するために試験された。しかしながら、rAAVアプローチは、機能性タンパク質3、4の発現を維持するために繰り返し注射を必要とする。したがって、DMD患者においてジストロフィン遺伝子発現を効果的かつ永続的に回復できる戦略が必要である。DMDのマウスモデルであるDmdmdxマウスは、早期終了コドンを導入するジストロフィン遺伝子のエキソン23に点変異を有し、C末端ジストログリカン結合ドメインを欠く非機能的切り捨てタンパク質をもたらす。最近の研究は、小・大型動物5、6、7における正確な遺伝子矯正または変異性エキソン欠失によるジストロフィン遺伝子発現を回復させるCRISPR/Cas9技術の使用を実証した。Long et al.8は、相同性修復(HDR)ベースのCRISPR/Cas9ゲノム編集によりDmdmdxマウス生殖細胞系におけるジストロフィン遺伝子変異を修正する方法を報告した。El Refaey et al.9は、rAAVがジストロフィーマウスで変異型エキソン23を効率的に排除できると報告した。これらの研究では、gRNAは、非相同末端接合(NHEJ)を介してDNA修復後にジストロフィン発現を部分的に回復させた二本鎖DNA切断を引き起こすために、イントロン20および23で設計された。さらにエキサイティングな、Amoasii et al.10は最近、イヌモデルにおけるジストロフィン発現の復元におけるrAAV媒介性CRISPR遺伝子編集の有効性と実現可能性を報告した。
DMDはまた、幹細胞障害11を引き起こす。筋肉の損傷のために, 住宅の筋肉幹細胞は、筋肉分化後に死にかけている筋肉細胞を補充します。.しかしながら、損傷および修復の連続したサイクルは、筋幹細胞12におけるテロメアの短縮、および幹細胞プール13、14の早期枯渇につながる。したがって、自家幹細胞療法とジストロフィン発現を回復させるゲノム編集の組み合わせは、DMDを治療するための実用的なアプローチでありうたることができる。CRISPR/Cas9技術は、機能的な筋肉再生のための自己的に修正された多能性幹細胞(iPSC)を生成し、免疫拒絶反応を引き起こさずにDMDのさらなる合併症を防ぐ可能性を提供します。しかし、iPSCは腫瘍形成のリスクがあり、筋原性前駆細胞へのiPSCの分化によって緩和される可能性がある。
このプロトコルでは、非統合センダイウイルスを用いてDmdmdxマウスの真皮線維芽細胞をiPSCに再プログラミングし、CRISPR/Cas9ゲノム欠失によりジストロフィン発現を回復することを説明する。ジェノタイピングによるiPSCにおけるExon23欠失の検証後、筋染発性筋原分化によりゲノム補正iPSCを筋原性前駆体(MPC)に分化した。
Protocol
Representative Results
Discussion
デュシェンヌ筋ジストロフィー(DMD)は、ジストロフィンの欠如を特徴とする破壊的で最終的に致命的な遺伝性疾患であり、進行性筋萎縮症1、2を引き起こす。我々の結果は、CRISPR/Cas9媒介exon23欠失のアプローチにより、Dmdmdx iPSC由来筋原性前駆細胞におけるジストロフィン遺伝子発現の回復を実証した。この方法には 3 つの利点があります。<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
タンとワイントラウブは、NIH-AR070029、NIH-HL086555、NIH-HL134354によって部分的にサポートされました。
Materials
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 | |
References
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