CRISPR/Cas9 teknologi i gjenopprette Dystrofingenet uttrykk i iPSC-avledet Muscle forfedre
Summary
Her presenterer vi en Cas9-basert exon23 sletting protokoll for å gjenopprette dystrofingenet uttrykk i iPSC fra DMDMDX mus-avledet hud fibroblaster og direkte differensiere iPSCs til myogenic stamceller (MPC) ved hjelp av tet-on MyoD aktiveringssystem.
Abstract
Duchenne muskuløse dystrofi (DMD) er en alvorlig progressiv muskel sykdom forårsaket av mutasjoner i dystrofingenet genet, som til slutt fører til utmattelse av muskel stamceller. Gruppert regelmessig oppdelt korte palindromic repetisjoner/CRISPR-Associated 9 (CRISPR/Cas9) genredigering har potensiale til å gjenopprette uttrykk for det dystrofingenet genet. Autologous indusert Pluripotent stamceller (iPSCs)-avledet muskel stamceller (MPC) kan etterfylle stammen/Stamcelle utvalget, reparere skader, og hindre ytterligere komplikasjoner i DMD uten å forårsake en immunrespons. I denne studien introduserer vi en kombinasjon av CRISPR/Cas9 og ikke-integrerte iPSC-teknologier for å få muskel forfedre med gjenopprettede dystrofingenet protein uttrykk. Kort, bruker vi en ikke-integrere Sendai vektor å etablere en iPSC linje fra dermal fibroblaster av DMDMDX mus. Vi bruker deretter CRISPR/Cas9 sletting strategi for å gjenopprette dystrofingenet uttrykk gjennom en ikke-homologe slutten sammenføyning av reframed dystrofingenet genet. Etter PCR validering av exon23 nedbryting i tre kolonier fra 94 plukket iPSC kolonier, skiller vi iPSC inn MPC av Doxycycline (dox)-indusert uttrykk for MyoD, en nøkkel transkripsjon faktor spiller en betydelig rolle i regulering muskel differensiering. Våre resultater viser muligheten for å bruke CRISPR/Cas9 sletting strategi for å gjenopprette dystrofingenet uttrykk i iPSC-avledet MPC, som har betydelig potensial for å utvikle fremtidige terapier for behandling av DMD.
Introduction
Duchenne muskuløse dystrofi (DMD) er en av de vanligste muskuløse dystrofi og er karakterisert ved fravær av dystrofingenet, som berører 1 av ca 5 000 nyfødte gutter over hele verden1. Tap av dystrofingenet gen funksjon resulterer i strukturelle muskel feil som fører til progressiv myofibers degenerasjon1,2. Rekombinant adeno-Associated virus (rAAV)-mediert genterapi system har blitt testet for å gjenopprette dystrofingenet uttrykk og forbedre muskel funksjon, som for eksempel gen erstatning ved hjelp av mikro-dystrophins (μ-Dys). Imidlertid krever rAAV tilnærming gjentatte injeksjoner å opprettholde uttrykk for den funksjonelle protein3,4. Derfor trenger vi en strategi som kan gi effektivt og permanent gjenopprette dystrofingenet genuttrykk hos pasienter med DMD. DMDMDX musen, en mus modell for DMD, har et punkt mutasjon i ekson 23 av dystrofingenet genet som introduserer en tidlig avslutning Codon og resulterer i en ikke-funksjonell avkortet protein mangler C-terminal dystroglycan bindende domene. Nyere studier viste bruk av CRISPR/Cas9 teknologi for å gjenopprette dystrofingenet genuttrykk ved nøyaktig gen korreksjon eller mutant ekson sletting i små og store dyr5,6,7. Long et al.8 rapporterte metoden for korrigering av dystrofingenet genet mutasjon i DMDMDX mus germline av homologi-regissert reparasjon (HDR) basert CRISPR/Cas9 Genova redigering. El Refaey et al.9 rapporterte at rAAV kunne effektivt avgiftsdirektoratet den muterte ekson 23 i dystrophic mus. I disse studiene, gRNAs ble utformet i introns 20 og 23 for å forårsake dobbel-strandet DNA pauser, som delvis restaurert dystrofingenet uttrykk etter DNA reparasjon via ikke-homologe ende sammenføyning (NHEJ). Enda mer spennende, Amoasii et al.10 nylig rapportert effekten og gjennomførbarhet av rAAV-mediert CRISPR genredigering i å gjenopprette dystrofingenet uttrykk i canine modeller, et viktig skritt i fremtidig klinisk anvendelse.
DMD fører også til Stamcelle forstyrrelser11. For muskel skade, bolig muskel stamceller fylle døende muskelceller etter muskel differensiering. Men, påfølgende sykluser av skade og reparasjon føre til forkortelse av telomerer i muskel stamceller12, og for tidlig tømming av Stamcelle bassengene13,14. Derfor kan en kombinasjon av autologous stilk cellen terapi med Genova redigering for å gjenopprette dystrofingenet uttrykk være en praktisk tilnærming for behandling DMD. Den CRISPR/Cas9 teknologi gir mulighet for å generere autologous genetisk korrigert indusert Pluripotent stamceller (iPSC) for funksjonell muskel regenerering og hindre ytterligere komplikasjoner av DMD uten å forårsake immun avvisning. Men iPSCs har en risiko for tumor dannelse, som kan bli lindres av differensiering av iPSC inn myogenic stamceller.
I denne protokollen, beskriver vi bruken av ikke-integrere Sendai virus til omprogrammering dermal fibroblaster av DMDMDX mus til iPSCs og deretter gjenopprette dystrofingenet uttrykk ved CRISPR/Cas9 Genova sletting. Etter godkjenningen av Exon23 overstrekingen inne iPSC av genotyperingteknologi, vi differensiert Genova-korrigerte iPSC i myogenic forfedre (MPC) via MyoD-indusert myogenic differensiering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Duchenne muskuløse dystrofi (DMD) er en destruktiv og til syvende og sist dødelig arvelig sykdom preget av mangel på dystrofingenet, fører til progressiv muskel atrofi1,2. Våre resultater viser den restaurerte dystrofingenet genuttrykk i DMDMDX IPSC-avledet myogenic stamceller ved TILNÆRMINGEN av CRISPR/Cas9-mediert exon23 sletting. Denne tilnærmingen har tre fordeler.
Først genererte vi iPSCs fra DMDMDX m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tang og Weintraub ble delvis støttet av NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
Materials
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 | |
References
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
- Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
- Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
- Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
- Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
- Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
- Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
- Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
- Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
- Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244 (2015).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).
