Technologie CRISPR/Cas9 dans la restauration de l'expression de la dystrophine chez les progéniteurs musculaires dérivés de l'iPSC
Summary
Ici, nous présentons un protocole de suppression d’exon23 basé cas9 pour reconstituer l’expression de dystrophine dans l’iPSC des fibroblastes de peau souris-dérivés de Dmd et différencient directement des iPSC en cellules myogènes de progéniture (MPC) utilisant le système d’activation de Tet-on MyoD.
Abstract
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie musculaire progressive grave provoquée par des mutations dans le gène de dystrophine, qui mène finalement à l’épuisement des cellules progénitrices de muscle. L’édition génétique de 9 (CRISPR/Cas9) a le potentiel de restaurer l’expression du gène de la dystrophine. Les cellules progénitrices musculaires induites autologues (iPSC) dérivées de cellules musculaires (MPC) peuvent reconstituer la piscine de cellules souches/progénitrices, réparer les dommages et prévenir d’autres complications dans la DMD sans provoquer de réponse immunitaire. Dans cette étude, nous introduisons une combinaison de technologies CRISPR/Cas9 et iPSC non intégrées pour obtenir des progéniteurs musculaires avec l’expression récupérée de protéine de dystrophine. En bref, nous utilisons un vecteur Sendai non-intégration pour établir une ligne iPSC à partir de fibroblastes dermiques de souris Dmdmdx. Nous utilisons ensuite la stratégie de suppression CRISPR/Cas9 pour restaurer l’expression de la dystrophine par une jointure non-homologue du gène recadré de dystrophine. Après la validation de PCR de l’épuisement d’exon23 dans trois colonies de 94 colonies choisies d’iPSC, nous différencions iPSC en MPC par l’expression doxycycline (Dox)-induite de MyoD, un facteur de transcription clé jouant un rôle significatif en réglant la différenciation de muscle. Nos résultats montrent la faisabilité d’utiliser la stratégie de suppression CRISPR/Cas9 pour restaurer l’expression de la dystrophine dans le MPC dérivé de l’iPSC, qui a un potentiel important pour développer de futures thérapies pour le traitement de la DMD.
Introduction
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est l’une des dystrophies musculaires les plus communes et se caractérise par l’absence de dystrophine, affectant 1 des quelque 5 000 garçons nouveau-nés dans le monde1. La perte de la fonction de gène de dystrophine a comme conséquence des défauts structurels de muscle menant à la dégénérescence progressive de myofibers1,2. Le système de thérapie génique à médiation adéno-associée (rAAV) a été testé pour restaurer l’expression de la dystrophine et améliorer la fonction musculaire, comme le remplacement des gènes à l’aide de micro-dystrophines(Dys). Cependant, l’approche rAAV nécessite des injections répétées pour soutenir l’expression de la protéine fonctionnelle3,4. Par conséquent, nous avons besoin d’une stratégie qui peut fournir l’expression efficace et permanente de gène de dystrophine dans les patients présentant Le DMD. La souris Dmdmdx, un modèle de souris pour DMD, a une mutation de point dans l’exon 23 du gène de dystrophine qui introduit un codon prématuré de terminaison et a comme conséquence une protéine tronquée non fonctionnelle manquant du domaine de liaison de Dystroglycan C-terminal. Des études récentes ont démontré l’utilisation de la technologie CRISPR/Cas9 pour restaurer l’expression du gène de la dystrophine par correction génétique précise ou suppression d’exon mutant chez les petits et grands animaux5,6,7. Long et coll.8 ont rapporté la méthode pour corriger la mutation du gène de la dystrophine dans la lignée germinale de souris Dmdmdx par réparation dirigée par homologie (HDR) basée sur l’édition du génome CRISPR/Cas9. El Refaey et coll.9 ont rapporté que le rAAV pouvait exciser efficacement l’exon 23 mutant chez les souris dystrophiques. Dans ces études, les gRNAs ont été conçus dans les introns 20 et 23 pour causer des ruptures d’ADN à double brin, qui ont partiellement restauré l’expression de dystrophine après réparation d’ADN par l’intermédiaire de jointure de fin non-homologue (NHEJ). Encore plus excitant, Amoasii et coll.10 ont récemment signalé l’efficacité et la faisabilité de l’édition du gène CRISPR par le rAAV dans la restauration de l’expression de la dystrophine dans les modèles canins, une étape essentielle dans l’application clinique future.
DMD provoque également des troubles des cellules souches11. Pour les dommages musculaires, les cellules souches musculaires résidentielles réapprovisionnent les cellules musculaires mourantes après la différenciation musculaire. Cependant, les cycles consécutifs de blessures et de réparation conduisent à un raccourcissement des télomères dans les cellules souches musculaires12, et l’épuisement prématuré des piscines de cellules souches13,14. Par conséquent, une combinaison de thérapie autologue de cellules souches avec l’édition de génome pour reconstituer l’expression de dystrophine peut être une approche pratique pour traiter DMD. La technologie CRISPR/Cas9 offre la possibilité de générer des cellules souches pluripotentes induites induites génétiquement corrigées autologues (iPSC) pour la régénération fonctionnelle des muscles et prévenir d’autres complications de la DMD sans provoquer de rejet immunitaire. Cependant, les iPSC ont un risque de formation de tumeur, qui pourrait être allégé par la différenciation de l’iPSC en cellules progénitrices myogéniques.
Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation du virus Sendai non-intégration pour reprogrammer les fibroblastes dermiques des souris dmdmdx en iPSCs et récupérons ensuite l’expression de dystrophine par suppression de génome de CRISPR/Cas9. Après validation de la suppression d’Exon23 dans l’iPSC par génotypage, nous avons différencié l’iPSC genome-corrected en progéniteurs myogéniques (MPC) par la différenciation myogène MyoD-induite.
Protocol
Representative Results
Discussion
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie héréditaire destructrice et finalement mortelle caractérisée par un manque de dystrophine, menant à l’atrophie progressive de muscle1,2. Nos résultats démontrent l’expression rétablie de gène de dystrophin dans les cellules myogenic de progéniture d’iPSC d’iPSC par l’approche de la suppression CRISPR/Cas9-négociée d’exon23. Cette approche présente trois avantages.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tang et Weintraub ont été partiellement soutenus par NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
Materials
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 | |
References
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