המטרה של הפרוטוקול הזה היא לתאר את הגישה החדשה מידול סרטן השד מבוסס על הזרקת הפנים של יצור-הבעת אדנווירוס לתוך בלוטות החלב של העכבר. גישה זו מאפשרת גם מניפולציה ייחודית לסוג תא ולעוגב של אירועים אונגניים באופן זמני מבוקר.
סרטן השד הוא מחלה הטרוגנית, אולי בשל אינטראקציות מורכבות בין תאים שונים של מקורות ואירועים אונגניים. מודלים של עכברים הם אינסטרומנטלי בהשגת תובנות לתהליכים מורכבים אלה. למרות שדגמים רבים של העכבר פותחו כדי ללמוד תרומות של אירועים אונגניים שונים ותאים של המקור חזה tuמוריגנזה, מודלים אלה הם לעתים קרובות לא תא סוג או איבר ספציפי או לא יכול לגרום לחניכה של הפטמות tuמוריגנזה ב אופן זמני מבוקר. כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי ליצור סוג חדש של מודלים העכבר של סרטן השד מבוסס על הזרקת הפנים של המין-הביע אדנווירוס (לספירה) לתוך בלוטות החלב של העכבר (MGs). בשל הזרקה ישירה של לספירה לתוך צינורות החלב, גישה זו היא מיוחדת MG, ללא כל האינדוקציה סרטן בלתי רצויות באיברים אחרים. ההליך הזרקת הפנים ניתן לבצע בעכברים בשלבים שונים של פיתוח MG שלהם (ובכך, זה מאפשר שליטה הטמפורלית של האינדוקציה לסרטן, החל מ ~ 3-4 שבועות של גיל). ניתן להשיג את הספציפיות לסוג התא באמצעות היזמים שונים ספציפיים לסוג תא לכונן ביטוי היצור בווקטור אדנונגיפי. אנו מראים כי הלומיאל ותאי האפיתל של הפטמות הבזליים (MECs) יכול להיות ממוקד הדוק עבור מניפולציה הגנטית מבוססי לוטל/loxP באמצעות הזרקה הפנים של Ad-אני מתחת לשליטה של קרטין 8 או קרטין 5 מקדם, בהתאמה. על-ידי שילוב של כתב מותנה כתבת (למשל, בעלי מטרה/inducible Rosa26-YFP ), אנו מראים כי mecs ממוקד על ידי לספירה, ואת התאים הסרטניים נגזר מהם, ניתן לעקוב על ידי ביצוע העיתונאי-חיובי תאים לאחר הזרקה הפנימי.
המטרה הכללית של שיטה זו היא לפתח גישה חדשה מידול סרטן השד מבוסס על הזרקה הפנים של לספירה לתוך העכבר MG. הגישה הגנטית של שילוב מבוסס-loxP שימש באופן נרחב כדי לדגמן סרטן השד האנושי בעכברים. הדור הראשון של מודלים מבוססי סרטן השד המבוססת על העכבר מופקים על ידי שימוש בעכברים המבטא המגניים תחת השליטה של MEC ספציפיים היזמים (למשל, Mmtv-היצורים עבור הלומיאל mecs וחלק של הבסיס mecs, Wap- היצור ו בעלי הושלתי ומכתשיים לומיאל מכתשי, K14- היצור עבור בסיס וחלק של הלומיאל mecs1,2,3,4,5)6, מיכל סבן , בן שמונה , 9. עם זאת, בעוד שורות אלה היצורים הטרנסגניים לאפשר שליטה מרחבית של ביטוי היצור (כלומר, בקבוצות משנה שונות של mecs), הם אינם מאפשרים שליטה טמפורלית של ביטוי המין ו-מניפולציה גנטי loxp-תיווך. הדור השני של מודלים מבוססי סרטן השד המבוססת על העכבר לנצל inducible היצירה/ביטוי גישות (g., השימוש של היצור-היתוך קולטן אסטרוגן [CreER], אשר יכול רק לגרום ליצור/loxP שילוב מחדש על הממשל של טמוקסיפן), ו כתוצאה מכך, אלה כלים גנטיים היתר בקרות מרחבית ושליטה טמפורלית של הפעלת אירועים אונגניים ב mecs (למשל, K8-creer-ו K5-creerמודלים מבוססי)10,11,12 . בשני הדורות של מודלים העכבר סרטן השד, כמו היזמים משמש לנהוג ביטוי של היצור או CreER (למשל, Krt8, Krt5) עשוי להיות פעיל בתאי האפיתל של איברים אחרים (כלומר, הם תא סוג ספציפי אבל לא האיבר ספציפי) או יש ביטוי דולף סוגי תאים אחרים מאשר תאים אפיתל (למשל, Mmtv, אשר יש דליפה פעילות במח העצם המטבית), גישות אלה עלולה להוביל לפיתוח של סרטן לא רצויות (s) באיברים אחרים (s). אם אלה סרטן בלתי צפוי לגרום שטחיות בעכברים מושפעים, המטרה המקורית של סרטן השד מידול בעכברים האלה עשויים להיות אסורים (למשל, Mmtv-מונחה יצורים האירועים אונגניים עלול להוביל ממאירות המטתית ומוות מוקדם של העכברים , בשל הדביקות של היזם Mmtv בתאי המטפאות)4.
כאן אנו מדווחים על גישת מידול סרטן השד בעכברים המאפשר גם מניפולציה מסוג תא-ו-איבר ספציפי של אירועים אונגניים באופן זמני מבוקרת. גישה זו מבוססת על הזרקה הפנים של לספירה לתוך העכבר MGs (והוא, ובכך, האיבר ספציפי). ביטוי היצור יכול להיות נשלט באמצעות היזמים שונים מסוג MEC משנה ספציפיים מוטבע וקטור אדנונגיפי (למשל, Krt8 עבור לומיאל Mecs, Krt5 עבור בסיס הבסיס, ובכך להשיג ספציפיים להתאים את התאים). האינדוקציה סרטן ב MGs יכול להיות נשלט באופן זמני על ידי הזרקה של לספירה לתוך עכברים בגילאים שונים, החל מ 3-4 שבועות של גיל (pubertal) לשלב המבוגר.
ההצלחה של גישה זו לגרימת גידולים בפטמות מקבוצות משנה שונות של MECs מסתמך לא רק על בחירת מתאים מסוג התא המתאים היזמים (כדי לנהוג ביטוי היצור) אבל גם על הליך הזרקת הפנים עצמו. הרעיון מאחורי הגישה הזאת הוא כי וירוסים מוזרק לאחר הספירה נשמרים עץ ductal, שהוא מבנה מוסתר עם לומן, ולכן, רק MECs חשופים לווי?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) גרנט R01 CA222560 ועל ידי המחלקה להגנה פריצת דרך פרס W81XWH-18-1-0037.
33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L |