Modelar el cáncer de mama a través de una inyección intraductal de Adenovirus C-expreso en la Glándula Mamaria del Ratón
Summary
El objetivo de este protocolo es describir un nuevo enfoque de modelado de cáncer de mama basado en la inyección intraductal de adenovirus Cre-expressing en las glándulas mamarias del ratón. Este enfoque permite la manipulación específica del tipo de célula y del órgano de los eventos oncogénicos de una manera controlada temporalmente.
Abstract
El cáncer de mama es una enfermedad heterogénea, posiblemente debido a interacciones complejas entre diferentes células de origen y eventos oncogénicos. Los modelos de ratón son fundamentales para obtener información sobre estos procesos complejos. Aunque muchos modelos de ratón se han desarrollado para estudiar las contribuciones de varios eventos oncogénicos y células de origen a la tumorigenesis de mama, estos modelos a menudo no son de tipo celular u órgano específico o no pueden inducir el inicio de la tumorigenesis mamaria en un temporalmente controlado. Aquí describimos un protocolo para generar un nuevo tipo de modelos de ratón de cáncer de mama basados en la inyección intraductal de adenovirus Cre-expressing (Ad-Cre) en glándulas mamarias de ratón (GM). Debido a la inyección directa de Ad-Cre en los conductos mamarios, este enfoque es específico de MG, sin ninguna inducción de cáncer no deseado en otros órganos. El procedimiento de inyección intraductal se puede realizar en ratones en diferentes etapas de su desarrollo MG (por lo tanto, permite el control temporal de la inducción del cáncer, a partir de las 3-4 semanas de edad). La especificidad del tipo de célula se puede lograr mediante el uso de diferentes promotores específicos del tipo de celda para impulsar la expresión Cre en el vector adenoviral. Mostramos que las células epiteliales mamarias luminales y basales (MEC) pueden estar estrechamente dirigidas a la manipulación genética basada en Cre/loxP a través de una inyección intraductal de Ad-Cre bajo el control del promotor de queratina 8 o queratina 5, respectivamente. Al incorporar un reportero Condicional de Cre (por ejemplo, reportero Rosa26-YFP inducible cre/loxP), mostramos que los MEC atacados por Ad-Cre, y las células tumorales derivadas de ellos, se pueden rastrear siguiendo las células positivas del reportero después de la inyección intraductal.
Introduction
El objetivo general de este método es desarrollar un nuevo enfoque de modelado de cáncer de mama basado en una inyección intraductal de Ad-Cre en el ratón MG. El enfoque genético basado en la recombinación Cre/loxP se ha utilizado ampliamente para modelar el cáncer de mama humano en ratones. La primera generación de modelos de ratón de cáncer de mama basados en Cre/loxP se generan mediante el uso de ratones transgénicos Con confirmación de Cre bajo el control de promotores específicos de MEC (por ejemplo, MMTV-Cre para MECs luminales y una parte de MECs basales, Wap-Cre y Blg-Cre para progenitores luminales y MECs luminales alveolales, K14-Cre para basal y una porción de MECs luminales1,2,3,4,5)6, 7 , 8 , 9. Sin embargo, si bien estas líneas transgénicas Cre permiten el control espacial de la expresión Cre (es decir, en diferentes subconjuntos de MEC), no permiten el control temporal de la expresión Cre y la manipulación genética mediada por Cre/loxP. La segunda generación de modelos de ratón de cáncer de mama basados en Cre/loxP utilizan enfoques inducibles de actividad/expresión de Cre (por ejemplo, el uso de fusión de receptores Cre-estrógeno [CreER], que sólo puede inducir la recombinación de Cre/loxP tras la administración de tamoxifeno), y como resultado, estas herramientas genéticas permiten controles espaciales y temporales de la activación de eventos oncogénicos en MEC (por ejemplo, modelos basados en K8-CreER– y K5-CreER)10,11,12 . En ambas generaciones de modelos de ratones con cáncer de mama, como promotores utilizados para impulsar la expresión Cre o CreER (por ejemplo, Krt8, Krt5) también pueden estar activos en células epiteliales de otros órganos (es decir, son específicos del tipo celular pero no específicos del órgano) o tienen una expresión de fuga en tipos celulares distintos de las células epiteliales (por ejemplo, MMTV, que tiene actividad con fugas en las células hematopoyéticas de la médula ósea), estos enfoques pueden conducir al desarrollo de cáncer(es) no deseado(s) en otros órganos. Si estos cánceres inesperados causan letalidad en los ratones afectados, el propósito original de modelar el cáncer de mama en estos ratones puede estar prohibido (por ejemplo, eventos oncogénicos impulsados por MMTV-Crepueden conducir a neoplasias malignas hematopoyéticas y muerte temprana de los ratones , debido a la fuga del promotor mmTV en células hematopoyéticas)4.
Aquí informamos de un enfoque de modelado de cáncer de mama en ratones que permite la manipulación específica del tipo de célula y del órgano de eventos oncogénicos de una manera controlada temporalmente. Este enfoque se basa en una inyección intraductal de Ad-Cre en los MG de ratón (y es, por lo tanto, específico del órgano). La expresión Cre se puede controlar utilizando diferentes promotores específicos de subpoblación MEC incrustados en el vector adenoviral (por ejemplo, Krt8 para MECs luminales, Krt5 para MECbasals, logrando así la especificidad de tipo celular). La inducción del cáncer en MG se puede controlar temporalmente mediante una inyección de Ad-Cre en ratones a diferentes edades, desde los 3-4 semanas de edad (pubertad) hasta la etapa adulta.
Protocol
Representative Results
Discussion
El éxito de este enfoque para inducir tumores mamarios de diferentes subpoblaciones de MEC se basa no sólo en la elección de promotores específicos de tipo celular apropiados (para impulsar la expresión De) sino también en el propio procedimiento de inyección intraductal. La idea detrás de este enfoque es que los virus Ad-Cre inyectados se retienen en el árbol ductal, que es una estructura oculta con lumen, y por lo tanto, sólo los MEC están expuestos a los virus y están infectados por Ad-Cre. Debido al espac…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la subvención R01 CA222560 de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y por el Premio Breakthrough del Departamento de Defensa W81XWH-18-1-0037.
Materials
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L | |
References
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