CRE-ifade Adenovirus fare mammary bezi içine bir Intraductal enjeksiyon yoluyla meme kanseri modelleme
Summary
Bu protokol amacı yeni bir meme kanseri modelleme yaklaşımı CRE-ifade adenovirüsü fare meme bezleri içine intraduktal enjeksiyon dayalı açıklamak için. Bu yaklaşım, Onkojenik olayların hem hücre tipi hem de Organ spesifik manipülasyon geçici olarak kontrollü bir şekilde sağlar.
Abstract
Meme kanseri heterojen bir hastalıktır, muhtemelen kökenleri ve Onkojenik olayların farklı hücreler arasındaki karmaşık etkileşimler nedeniyle. Fare modelleri, bu karmaşık süreçlere bilgi kazanma konusunda enstrümantal. Birçok fare modeli, çeşitli Onkojenik olayların ve menşe hücrelerinin meme tümörijenezde katkıları çalışmak için geliştirilmiştir rağmen, bu modeller genellikle hücre tipi veya Organ spesifik değildir veya bir içinde meme tümörijenezde başlamasını teşvik edemez geçici olarak kontrollü bir şekilde. Burada CRE-ifade adenovirüsü (ad-CRE) fare meme bezleri (MGS) içine intraduktal enjeksiyon dayalı meme kanseri fare modelleri yeni bir tür oluşturmak için bir protokol açıklanmaktadır. Ad-CRE ‘ nin meme kanallarına doğrudan enjekte edilmesi nedeniyle, bu yaklaşım diğer organlarda herhangi bir istenmeyen kanser indüksiyonu olmaksızın MG spesifik olarak görülmektedir. İntraduktal enjeksiyon prosedürü fareler içinde kendi mg gelişimi farklı aşamalarında yapılabilir (böylece, kanser indüksiyon temporal kontrole izin verir, başlayarak ~ 3-4 hafta yaş). Hücre tipi özgüllüğü, Adenoviral Vektördeki CRE ifadesini götürmek için farklı hücre türüne özgü promotörler kullanılarak elde edilebilir. Biz luminal ve bazal meme epitelyal hücreler (MECS) sıkı CRE/loxp tabanlı genetik manipülasyon Keratin 8 veya Keratin 5 Promoter, sırasıyla ad-CRE bir intraduktal enjeksiyon yoluyla hedeflenebilir olduğunu göstermektedir. Koşullu bir CRE muhabiri (örn., CRE/loxp-indüklenebilir Rosa26-YFP Reporter) ekleyerek, reklam-CRE tarafından hedeflenen MECS ve onlardan türeyen tümör hücreleri, intraduktal enjeksiyon sonrasında muhabir-pozitif hücreleri takip ederek takip edilebilir.
Introduction
Bu yöntemin genel hedefi fare mg içine ad-CRE bir intraduktal enjeksiyon dayalı yeni bir meme kanseri modelleme yaklaşımı geliştirmektir. CRE/loxP rekombinasyon tabanlı genetik yaklaşım yaygın farelerde insan meme kanseri modeli için kullanılmıştır. CRE/loxP tabanlı meme kanseri fare modellerinin ilk nesil MEC özgü promotörler kontrolü altında CRE-ifade transjenik fareler kullanılarak oluşturulur (örneğin, luminal MECs için Mmtv-CRE ve bazal MECS bir kısmı, WAP-CRE ve Luminal projenatörler ve alveoler luminal MECs için blg-CRE, bazal Için K14-CRE ve luminal MECS bir kısmı1,2,3,4,5)6, 7 , 8 , 9. ancak, bu CRE transjenik hatları CRE ifadesinin uzamsal kontrolünü etkinleştirirken (yani, MECS farklı alt kümelerinde), CRE Ifadesi ve CRE/loxp-aracılı genetik manipülasyon temporal kontrole izin vermez. CRE/loxP tabanlı meme kanseri fare modellerinin ikinci nesil indüklenebilir CRE aktivite/ifade yaklaşımlar (örneğin, CRE-estrojen reseptör Fusion kullanımı [CreER], hangi sadece Tamoxifen yönetimi üzerine CRE/loxP rekombinasyon neden olabilir) kullanmak ve Sonuç olarak, bu genetik araçlar MECS (örneğin, K8-creer-ve K5-creertabanlı modeller) Onkojenik olayların aktivasyonunun hem uzamsal ve temporal kontrolleri izin verir10,11,12 . Meme kanseri fare modellerinin her iki nesilde, CRE veya CreER ifadesi (örn., Krt8, Krt5) götürmek için kullanılan organizatörler olarak da diğer organların epitelyal hücrelerde aktif olabilir (yani, onlar hücre tipi özeldir ama organ özgü değil) veya epitelyal hücreler dışındaki hücre tiplerinde (örn., kemik iliği hematopoetik hücrelerde sızdıran aktivite olan Mmtv), bu yaklaşımlar diğer organlarda (s) istenmeyen kanserlerin gelişmesine yol açabilir. Bu beklenmeyen kanserler etkilenen farelerde kötülüğü neden olursa, bu fareler içinde modelleme meme kanserinin orijinal amacı yasaklanabilir (örn., Mmtv-CRE-Driven Onkojenik olaylar hematopoetik malignite ve fareler erken ölümü neden olabilir , hematopoetik hücrelerde mmtv Organizatör sızıntısı nedeniyle)4.
Burada bir meme kanseri modelleme yaklaşımı farelerde her iki hücre tipi-ve organ özgü manipülasyon geçici olarak kontrollü bir şekilde Onkojenik olayların sağlayan rapor. Bu yaklaşım, fare MGS içine ad-CRE bir intraduktal enjeksiyon dayanmaktadır (ve bu nedenle, organ özgü). CRE ifadesi, Adenoviral vektörü (örn., luminal MECs için Krt8 , bazal MECS için Krt5 , böylece hücre tipi özgüllüğü elde) gömülü farklı MEC alt nüfus özgü promotörler kullanılarak kontrol edilebilir. MGs kanser indüksiyon temporally farklı yaşlarda fareler içine ad-CRE bir enjeksiyon ile kontrol edilebilir, başlayarak 3-4 hafta yaş (pubertal) Yetişkin aşamaya.
Protocol
Representative Results
Discussion
MECS farklı alt popülasyonlarının meme tümörleri inducing için bu yaklaşımın başarısı sadece uygun hücre tipi özgü promotörler (CRE ifade götürmek için) tercih değil, aynı zamanda intraduktal enjeksiyon prosedürü kendisi dayanır. Bu yaklaşımın arkasındaki fikir, enjekte edilen ad-CRE virüslerinin Lümen ile gizlenmiş bir yapı olan duktal ağacında korunduğunu ve bu nedenle, sadece MECs virüslere maruz kalmaktadır ve ad-CRE tarafından enfekte olmaktadır. Meme kanalları içinde sını…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NıH) Grant R01 CA222560 ve bölüm savunma atılım Ödülü W81XWH-18-1-0037 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L | |
References
- Wagner, K. U., et al. Cre-mediated gene deletion in the mammary gland. Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).
- Selbert, S., et al. Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland. Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).
- Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).
- van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells. eLife. 3, e03881 (2014).
- Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors. Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).
- Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).
- Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
- Liu, X., et al. Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Koren, S., et al. PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).
- Van Keymeulen, A., et al. Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity. Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).
- Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours. Nature Communications. 8, 14431 (2017).
- Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses. Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Nik-Zainal, S., et al. The life history of 21 breast cancers. Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).
- Abba, M. C., et al. A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ. Recherche en cancérologie. 75 (18), 3980-3990 (2015).
