الخياطة في فيفو الاختبارات الخلوية لدراسة المناعي في الأورام الخاصةCD8 + T الاستجابات الخلية
Summary
ونحن هنا وصف تدفق الخلوية التي تستند في الجسم الحيوي قتل الفحص الذي يتيح النظر في المناعية في الاستجابات اللمفاوية T السامة للخلايا (CTL) لنموذج مستضد الورم. ونحن نقدم أمثله علي كيفيه استخدام هذا الفحص الأنيق للدراسات الميكانيكية ولاختبار فعاليه المخدرات.
Abstract
كاربوكسيفلوريسسين الناجحة استر (cfse)-مقرها في اختبارات الخلايا الحيوية تمكين الحساسية ودقه الكمية منCD8 + لحل T اللمفاويات (CTL) الاستجابات التي اثارتها ضد الببتيدات المشتقة من الورم والممرض. هم يقدمون عده فوائد علي تقليديه قتل اختبارات. أولا ، انها تسمح برصد السمية الخلوية بوساطة CTL داخل الاجهزه اللمفاوية الثانوية سليمه معماريا ، وعاده في الطحال. ثانيا ، انها تسمح للدراسات الميكانيكية خلال المراحل فتيله ، المستجيب والاستدعاء من الاستجابات CTL. ثالثا ، انها توفر منصات مفيده لاختبار فعاليه اللقاح/المخدرات في بيئة الجسم الخارجي حقا. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول الأمثل لفحص الاستجابات CTL المصاحبة ضد أكثر من واحد من مرضبه الببتيد من نموذج مستضد الورم (Ag) ، وهي الفيروس simian 40 (SV40)-ترميز كبير T Ag (T Ag). مثل معظم البروتينات السرطانية ذات الصلة سريريا, T Ag الموانئ العديد من الببتيدات المناعية المحتملة. ومع ذلك ، فقط أربعه الببتيدات هذه للحث علي الاستجابات CTL للكشف في C57BL/6 الفئران. يتم ترتيب هذه الاستجابات باستمرار في ترتيب هرمي استنادا إلى حجمها ، والذي يشكل الأساس ل TCD8 “المناعية” في هذا النظام القوي. ووفقا لذلك ، يتركز الجزء الأكبر من الاستجابة tCD8 الخاصة t Ag ضد واحده السمية المناعية في حين يتم التعرف علي الثلاثة الأخرى المربه والرد علي ضعيف فقط. المناعي يهدد اتساع الاستجابات المضادة للورم TCD8 وهو ، علي هذا النحو ، يعتبره الكثيرون عائقا امام نجاح التطعيم ضد السرطان. ولذلك ، فمن المهم ان نفهم العوامل الخلوية والجزيئية واليات التي تملي أو تشكل TCD8 امودومنيانسي. البروتوكول الذي وصفناه هنا مصمم خصيصا لتحقيق هذه الظاهرة في نموذج التمنيع T Ag ، ولكن يمكن تعديله بسهوله وتوسيعه ليشمل دراسات مماثله في نماذج الأورام الأخرى. ونحن نقدم أمثله عن كيفيه قياس تاثير التدخلات العلاجية المناعية التجريبية باستخدام في اختبارات الخلوية الحيوية.
Introduction
التقليديةCD8 + t الخلايا (tCD8) تلعب أجزاء هامه في مراقبه المناعة المضادة للسرطان. انها تعمل في المقام الأول في قدره الخلايا اللمفاوية T لحل (ctls) التي تعترف الأورام الببتيد المرتبطة أو المقترنة (الحثالة) المعروضة داخل الشق المغلقة من مجمع التوافق النسيجي الرئيسي (mhc) الفئة الاولي الجزيئات. CTLs المسلحة بالبالكامل استخدام ترسانتها السامة للخلايا لتدمير الخلايا الخبيثة. يمكن الكشف عن السرطان TCD8 في الدورة الدموية أو حتى داخل الجماهير الابتدائية والمنتشرة من العديد من مرضي السرطان والحيوانية الحاملة للورم. ومع ذلك ، فانها غالبا ما تكون أنجيك أو استنفدت وتفشل في القضاء علي السرطان. ولذلك ، تم تصميم العديد من طرائق العلاج المناعي لزيادة المضادة للسرطان TCD8 الترددات واستعاده وتعزيز وظائفها.
البروتينات السرطانية الميناء العديد من الببتيدات ، وبعضها يمكن ان تكون مناعية ويحتمل ان تكون مناعية. ومع ذلك ، يتم استخلاصها الاستجاباتCD8 T قابله للقياس الكمي مع احجام متفاوتة ضد الببتيدات قليله فقط. هذا يخلق “التسلسل الهرمي المناعي” بين TCD8 استنساخ1. وفقا لذلك ، المناعية (ID) TCD8 تحتل الرتب الهرمية البارزة ، والتي يتم الحكم عاده من قبل وفره بهم. وعلي النقيض من ذلك ، فان خلايا TCD8 التي تكون مستقبلات الخلايا التائية (TCR) الخاصة بها محدده للفوقية المهيمنة (SD) التي تحدث في ترددات اقل. وقد حددنا نحن وغيرنا بعض العوامل التي تملي أو تشكل المناعة في استجابات TCD8 . وتشمل هذه ، من بين أمور أخرى ، طريقه تقديم ag إلى السذاجة TCD8 (اي ، العرض المباشر ، عبر العرض ، عبر خلع الملابس)2،3،4، ونوع من الخلايا تقديم ag (apcs) المشاركة في التنشيط TCD8 5، وفره واستقرار البروتين الحثالة6،7 وكفاءه وحركيه تدهورها من قبل بروتياسميس7،8، و الانتقائية النسبية للناقل المرتبطة تجهيز Ag (الحنفية) ل الببتيدات9، وتقارب الببتيدات المحررة لجزيئات mhc I9،10، وجود ، والترددات السلائف وتنوع TCR مشابه tCD8 in t الخلية تجمعات11،12،13، عبر المنافسة بين الخلايا t للوصول إلى apcs14،15، وقدره الاشقاء من tCD8 استنساخ16. الاضافه إلى ذلك ، يتم إخضاع TCD8 المناعي إلى أليات المناعية بوساطة عده أنواع الخلايا المثبطة مثل التي تحدث بشكل طبيعي t (nTreg) الخلايا17، والخلية سطح مشترك المثبطة المبرمجة الموت-1 (PD-1)16، وبعض الانزيمات داخل الخلايا مثل indoleamine 2 ، 3-ديوكسيجيناسي (IDO)18 والهدف الثدييات من راباميسين (mtor)19. ومع ذلك ، من المهم ان نلاحظ ان العوامل المذكورة أعلاه لا تمثل دائما بشكل كامل للمناعة.
وبصرف النظر عن البيولوجيا الاساسيه لل TCD8 المناعي ، فان فحص هذه الظاهرة المثيرة للاهتمام له اثار هامه في علم المناعة السرطانية والعلاج المناعي. أولا ، لا تمنح حاله المعرف بالضرورة القدرة علي منع بدء الورم أو التقدم فيه بالقياس إلى TCD8 . سواء وكيف ID و SD TCD8 المساهمة في المناعة انتيورم قد تكون معتمده علي نوع ومدي الأورام الخبيثة والنظام التجريبي المستخدمة. الثانية, ويعتقد ان معرف رCD8 استنساخ قد تكون ‘ مرئية جدا ‘ للجهاز المناعي التالي أكثر عرضه لليات التسامح المركزية و/أو المحيطي16,21. ثالثا ، قد تحتوي الأورام الميتوزي علي خلايا الأورام السرطانية التي تتجنب الكشف من قبل العديد ، ان لم يكن معظم ، CTLs من خلال عرض طيف ضيق من الببتيد: المجمعات MHC. في ظل هذه الظروف, TCD8 الردود من اتساع غير كافيه من المرجح ان تحمل مثل هذه الخلايا السرطانية ميزه البقاء علي قيد الحياة, التالي تحفيز نموها22. وللاسباب المذكورة أعلاه ان العديد من رؤية المناعية كعقبه لنجاح التلقيح القائم عليCD8T والعلاجات ضد السرطان.
تلقيح الفئران C57BL/6 مع الفيروس simian 40 (SV40)-الخلايا المتحولة التي تعبر عن الورم الكبير ag (t ag) يوفر نظام سريري قوي لدراسة TCD8 المناعي. هذا النموذج يقدم العديد من الفوائد. أولا ، وتتميز بشكل جيد في هذا الضغط الفار الببتيد من هذا البروتين oncoproteinه ذات الصلة سريريا ( الجدول1). الثانية ، T Ag المربية ، والتي تسمي المواقع الأول والثاني/الثالث والرابع والخامس ، والزناد TCD8 الردود التي يتم ترتيبها باستمرار في ترتيب التسلسل الهرمي التالي: الموقع الرابع > > موقع I ≥ الموقع الثاني/الثالث > > الموقع خامسا. جبل الاستجابة الأكثر قوه ل T Ag. وعلي النقيض من ذلك ، فان الموقعين الأول والثاني/الثالث مهيمنان ، والمواقع V الخاصة بالCD8 الخاصة هي اقل وفره وعاده ما تكون قابله للكشف فقط في غياب الاستجابة لغيرها من المرتوب23،24. ثالثا ، TAg + خط الخلايا السرطانية المستخدمة في البروتوكول الموصوف هنا ، وهي الخلايا الليفية C57SV ، وتلك المستخدمة في التحقيقات السابقة لدينا16،17،18،19 ,25,26, حولت مع [سوبجنومي] SV40 شظايا25. ولذلك ، فهي غير قادره علي تجميع والإفراج عن SV40 virions التي يحتمل ان تصيب APCs المضيف. الاضافه إلى ذلك ، C57SV الخلايا خاليه من جزيئات الكلاسيكية كوستيمولاتوري مثل CD80 (b7-1) ، CD86 (b7-2) ، و CD137 يجند (4-1bbl)16. السمات المذكورة أعلاه جعل هذه الخطوط مثاليه للفحص في الجسم الCD8 T تنشيط عبر فتيله. عبر فتيله هو المسار الرئيسي في حمل TCD8 الاستجابات ، وخاصه تلك التي أطلقت ضد الخلايا السرطانية من أصل غير الدم التي تفشل في الخلايا الاوليه الساذجة مباشره25.
ويمكن رصد الترددات المضادة للورم TCD8 و/أو وظائف من قبل mhc I تترامير تلطيخ ، تلطيخ داخل الخلايا للتوكسينات المستجيب (علي سبيل المثال ، مضادات التداخل [ifn]-γ) أو جزيئات الليتيك (علي سبيل المثال ، تثقيب) ، والانزيمات المرتبطة المناعية (elispot) والسابقين اختبارات الخلوية الفيفو. منذ بدايتها في 1990s27,28, كاربوكسيفلوريسسين الناجحة استر (cfse)-مقرها في الجسم الحيوي قتل اختبارات مكنت تقييم الاستجابات السامة للخلايا بوساطة ctls المضادة للفيروسات29,30 , 31، المضادة للورم ctls16،32، الطبيعية القاتلة (ناغورني كاراباخ) الخلايا33، glycolipid-الثابتة التفاعلية القاتل الطبيعي T (inkt) الخلايا34، والموجودة مسبقا والخاصة بالمانحين محدده الأجسام المضادة26. ولذلك ، فان تطبيقاتها يمكن ان تكون ذات فائده لقراء واسعه ، بما في ذلك ولكن لا تقتصر علي المحققين العاملين في مجالات المناعة الأورام والعلاج المناعي ، والمناعة المضادة للمرض ، وتصميم اللقاح الوقائي والعلاجي.
لتقييم الخلايا الخلوية بوساطة في السيناريوهات النموذجية ، يتم تسميه اثنين من السكان من الخلايا الطحال الساذجة التي تعرض اما Ag غير ذي صله أو Ag (s) المدرك مع جرعتين مختلفتين من CFSE ، مختلطة في اعداد متساوية وحقنها في ساذج (السيطرة) أو القاتل الفئران التي تاوي الخلايا. بعد ذلك يتم فحص وجود/غياب كل السكان المستهدفين عن طريق قياس التدفق الخلوي.
لدينا الأمثل والعاملين في الجسم الحيوي قتل الاختبارات في دراساتنا علي المناعية في كل من المضادة للفيروسات ومضادات الأورام TCD8 الاستجابات12,16,17. هنا ، ونحن نقدم بروتوكولا مفصلا لتقييم في وقت واحد من الهوية و SD TCD8 الردود علي الملحقات t Ag ، والتي يمكن اعتمادها بسهوله لتحقيقات مماثله في النظم التجريبية الأخرى. كما نقدم نتائج تمثيليه تبين ان استنزاف الخلايا nTreg و PD-1 الحصار يمكن ان تعزز بشكل انتقائي ID TCD8-و SD tCD8المستحثة للخلايا ، علي التوالي. وفي النهاية ، سنناقش المزايا المتعددة لاختبارات القتل المجرية فضلا عن بعض القيود المتاصله فيها.
Protocol
Representative Results
Discussion
المستندة إلى CFSE في اختبارات الخلوية الحيوية تقدم العديد من المزايا علي اختبارات القتل التقليدية مثل الكروم المشعة (51Cr) الإفراج والقياس اللوني لاكتات نازعه (ldh) الإفراج عن الاختبارات. أولا ، انها تسمح برصد وظيفة CTL داخل الجهاز اللمفاوي الثانوي سليمه معماريا.
ثانيا ، ان ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) منح ممسحة-130465 و PJT-156295 إلى SMMH. ويدعم المعهد جزئيا منحه الملكة اليزابيث الثانية للدراسات العليا في العلوم والتكنولوجيا من وزاره التدريب والكليات والجامعات في اونتاريو. وكان جيم حاصلا علي منحه الدراسات العليا من العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا (NSERC) من الكسندر غراهام بيل كندا.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3) | Bio X Cell | BE0012 | |
| Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14) | Bio X Cell | BE0146 | |
| CFSE | Thermo Fisher Scientific | C34554 | |
| DMEM (1X) | Thermo Fisher Scientific | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Bioproducts | 080-150 | Heat-inactivate prior to use |
| GlutaMAX (100X) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | 10 mM final concentration |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Stock is 100X |
| Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2) | SouthernBiotech | 0116-01 | Isotype control |
| Rat IgG1 (clone HRPN) | Bio X Cell | BE0088 | Isotype control |
| Rat IgG1 (clone TNP6A7) | Bio X Cell | BP0290 | Isotype control |
| Rat IgG2a (clone 2A3) | Bio X Cell | BP0089 | Isotype control |
| RPMI 1640 (1X) | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | 1 mM final concentration |
References
- Yewdell, J. W., Bennink, J. R. Immunodominance in major histocompatibility complex class I-restricted T lymphocyte responses. Annual Review of Immunology. 17, 51-88 (1999).
- Chen, W., et al. Reversal in the immunodominance hierarchy in secondary CD8+ T cell responses to influenza A virus: roles for cross-presentation and lysis-independent immunodomination. The Journal of Immunology. 173 (8), 5021-5027 (2004).
- Otahal, P., et al. Inefficient cross-presentation limits the CD8+ T cell response to a subdominant tumor antigen epitope. The Journal of Immunology. 175 (2), 700-712 (2005).
- Lauron, E. J., et al. Cross-priming induces immunodomination in the presence of viral MHC class I inhibition. PLoS Pathogens. 14 (2), e1006883 (2018).
- Crowe, S. R., et al. Differential antigen presentation regulates the changing patterns of CD8+ T cell immunodominance in primary and secondary influenza virus infections. The Journal of Experimental Medicine. 198 (3), 399-410 (2003).
- Probst, H. C., et al. Immunodominance of an antiviral cytotoxic T cell response is shaped by the kinetics of viral protein expression. The Journal of Immunology. 171 (10), 5415-5422 (2003).
- Gileadi, U., et al. Generation of an immunodominant CTL epitope is affected by proteasome subunit composition and stability of the antigenic protein. The Journal of Immunology. 163 (11), 6045-6052 (1999).
- Zanker, D., Waithman, J., Yewdell, J. W., Chen, W. Mixed proteasomes function to increase viral peptide diversity and broaden antiviral CD8+ T cell responses. The Journal of Immunology. 191 (1), 52-59 (2013).
- Deng, Y., Yewdell, J. W., Eisenlohr, L. C., Bennink, J. R. MHC affinity, peptide liberation, T cell repertoire, and immunodominance all contribute to the paucity of MHC class I-restricted peptides recognized by antiviral CTL. The Journal of Immunology. 158 (4), 1507-1515 (1997).
- Chen, W., Khilko, S., Fecondo, J., Margulies, D. H., McCluskey, J. Determinant selection of major histocompatibility complex class I-restricted antigenic peptides is explained by class I-peptide affinity and is strongly influenced by nondominant anchor residues. The Journal of Experimental Medicine. 180 (4), 1471-1483 (1994).
- Kotturi, M. F., et al. Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance. The Journal of Immunology. 181 (3), 2124-2133 (2008).
- Haeryfar, S. M., et al. Terminal deoxynucleotidyl transferase establishes and broadens antiviral CD8+ T cell immunodominance hierarchies. The Journal of Immunology. 181 (1), 649-659 (2008).
- Leon-Ponte, M., Kasprzyski, T., Mannik, L. A., Haeryfar, S. M. Altered immunodominance hierarchies of influenza A virus-specific H-2(b)-restricted CD8+ T cells in the absence of terminal deoxynucleotidyl transferase. Immunological Investigations. 37 (7), 714-725 (2008).
- Kedl, R. M., et al. T cells compete for access to antigen-bearing antigen-presenting cells. The Journal of Experimental Medicine. 192 (8), 1105-1113 (2000).
- Kastenmuller, W., et al. Cross-competition of CD8+ T cells shapes the immunodominance hierarchy during boost vaccination. The Journal of Experimental Medicine. 204 (9), 2187-2198 (2007).
- Memarnejadian, A., et al. PD-1 Blockade Promotes Epitope Spreading in Anticancer CD8(+) T Cell Responses by Preventing Fratricidal Death of Subdominant Clones To Relieve Immunodomination. The Journal of Immunology. 199 (9), 3348-3359 (2017).
- Haeryfar, S. M., DiPaolo, R. J., Tscharke, D. C., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. Regulatory T cells suppress CD8+ T cell responses induced by direct priming and cross-priming and moderate immunodominance disparities. The Journal of Immunology. 174 (6), 3344-3351 (2005).
- Rytelewski, M., et al. Suppression of immunodominant antitumor and antiviral CD8+ T cell responses by indoleamine 2,3-dioxygenase. PLoS One. 9 (2), e90439 (2014).
- Maleki Vareki, S., et al. Differential regulation of simultaneous antitumor and alloreactive CD8(+) T-cell responses in the same host by rapamycin. American Journal of Transplantation. 12 (1), 233-239 (2012).
- Irvine, K., Bennink, J. Factors influencing immunodominance hierarchies in TCD8+ -mediated antiviral responses. Expert Review of Clinical Immunology. 2 (1), 135-147 (2006).
- Grossmann, M. E., Davila, T., Celis, T. Avoiding tolerance against prostatic antigens with subdominant peptide epitopes. Journal of Immunotherapy. 24 (3), 237-241 (2001).
- Schreiber, H., Wu, T. H., Nachman, J., Kast, W. M. Immunodominance and tumor escape. Seminars in Cancer Biology. 12 (1), 25-31 (2002).
- Mylin, L. M., et al. Quantitation of CD8(+) T-lymphocyte responses to multiple epitopes from simian virus 40 (SV40) large T antigen in C57BL/6 mice immunized with SV40, SV40 T-antigen-transformed cells, or vaccinia virus recombinants expressing full-length T antigen or epitope minigenes. Journal of Virology. 74 (15), 6922-6934 (2000).
- Fu, T. M., et al. An endoplasmic reticulum-targeting signal sequence enhances the immunogenicity of an immunorecessive simian virus 40 large T antigen cytotoxic T-lymphocyte epitope. Journal of Virology. 72 (2), 1469-1481 (1998).
- Chen, W., et al. Cross-priming of CD8+ T cells by viral and tumor antigens is a robust phenomenon. European Journal of Immunology. 34 (1), 194-199 (2004).
- Memarnejadian, A., Meilleur, C. E., Mazzuca, D. M., Welch, I. D., Haeryfar, S. M. Quantification of Alloantibody-Mediated Cytotoxicity In Vivo. Transplantation. 100 (5), 1041-1051 (2016).
- Aichele, P., et al. Peptide antigen treatment of naive and virus-immune mice: antigen-specific tolerance versus immunopathology. Immunity. 6 (5), 519-529 (1997).
- Oehen, S., Brduscha-Riem, K. Differentiation of naive CTL to effector and memory CTL: correlation of effector function with phenotype and cell division. The Journal of Immunology. 161 (10), 5338-5346 (1998).
- Coles, R. M., Mueller, S. N., Heath, W. R., Carbone, F. R., Brooks, A. G. Progression of armed CTL from draining lymph node to spleen shortly after localized infection with herpes simplex virus 1. The Journal of Immunology. 168 (2), 834-838 (2002).
- Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. The Journal of Immunology. 171 (1), 27-31 (2003).
- Meilleur, C. E., et al. Bacterial superantigens expand and activate, rather than delete or incapacitate, preexisting antigen-specific memory CD8+ T cells. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Goldszmid, R. S., et al. Dendritic cells charged with apoptotic tumor cells induce long-lived protective CD4+ and CD8+ T cell immunity against B16 melanoma. The Journal of Immunology. 171 (11), 5940-5947 (2003).
- Oberg, L., et al. Loss or mismatch of MHC class I is sufficient to trigger NK cell-mediated rejection of resting lymphocytes in vivo – role of KARAP/DAP12-dependent and -independent pathways. European Journal of Immunology. 34 (6), 1646-1653 (2004).
- Wingender, G., Krebs, P., Beutler, B., Kronenberg, M. Antigen-specific cytotoxicity by invariant NKT cells in vivo is CD95/CD178-dependent and is correlated with antigenic potency. The Journal of Immunology. 185 (5), 2721-2729 (2010).
- Brinster, R. L., et al. Transgenic mice harboring SV40 T-antigen genes develop characteristic brain tumors. Cell. 37 (2), 367-379 (1984).
- Tatum, A. M., et al. CD8+ T cells targeting a single immunodominant epitope are sufficient for elimination of established SV40 T antigen-induced brain tumors. The Journal of Immunology. 181 (6), 4406-4417 (2008).
- Schell, T. D., Tevethia, S. S. Control of advanced choroid plexus tumors in SV40 T antigen transgenic mice following priming of donor CD8(+) T lymphocytes by the endogenous tumor antigen. The Journal of Immunology. 167 (12), 6947-6956 (2001).
- Greenberg, N. M., et al. Prostate cancer in a transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3439-3443 (1995).
