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Immunologie et infection

Adaptando os ensaios de citotoxicidade in vivo para estudar Imunodominância em respostas de células T CD8+ específicas do tumor

Published: May 06, 2019
doi:
10.3791/59531
, ,
1Department of Microbiology and Immunology,Western University, 2Department of Medicine, Division of Clinical Immunology and Allergy,Western University, 3Department of Surgery, Division of General Surgery,Western University, 4Lawson Health Research Institute

Summary

Nós descrevemos aqui um ensaio in vivo cytometry-baseado do fluxo da matança que permita a examinação do immunodominance em respostas citotóxicas do linfócito de T (CTL) a um antígeno modelo do tumor. Nós fornecemos exemplos de como este ensaio elegante pode ser empregado para estudos mecanistic e para o teste da eficácia da droga.

Abstract

Carboxyfluoresceína éster succinimidílico (CFSE)-com base in vivo ensaios de citotoxicidade permitem a quantificação sensível e precisa de CD8+ citolítico T linfócitos (CTL) respostas eliciadas contra tumor e peptídeos derivados de patógenos. Oferecem diversas vantagens sobre ensaios tradicionais da matança. Primeiramente, permitem a monitoração do citotoxicidade CTL-negociado dentro dos órgãos lymphoid secundários arquitetonicamente intactos, tipicamente no spleen. Segundo, eles permitem estudos mecanísticos durante as fases de priming, efetor e recall de respostas CTL. Em terceiro lugar, eles fornecem plataformas úteis para testes de eficácia de vacina/drogas em um ambiente verdadeiramente in vivo. Aqui, nós fornecemos um protocolo aperfeiçoado para a examinação de respostas concomitantes do CTL de encontro a mais de um epítopo do peptide de um antígeno modelo do tumor (AG), a saber, o vírus do Simian 40 (SV40)-codificado grande T AG (T AG). Como a maioria das outras proteínas tumorais clinicamente relevantes, o T AG abriga muitos peptídeos potencialmente imunogênicos. Entretanto, somente quatro tais peptídeos induzem respostas detectáveis de CTL em camundongos C57BL/6. Estas respostas são organizadas consistentemente em uma ordem hierárquica baseada em sua magnitude, que forma a base para o “immunodominance TCD8 ” neste sistema poderoso. Conformemente, a maioria da resposta t AG-específicaCD8 de t é focalizada de encontro a um único epítopo mapeado immunodominante quando os outros três epítopos forem reconhecidos e respondidos a somente fraca. A imunodominância compromete a amplitude das respostas antitumorais TCD8 e é, como tal, considerada por muitos como um impedimento para a vacinação bem-sucedida contra o cancro. Portanto, é importante compreender os fatores e mecanismos celulares e moleculares que ditam ou formam a imunodominância TCD8 . O protocolo que nós descrevemos aqui é costurado à investigação deste fenômeno no modelo da imunização de T AG, mas pode prontamente ser modificado e estendido aos estudos similares em outros modelos do tumor. Fornecemos exemplos de como o impacto das intervenções imunoterapêuticas experimentais pode ser medido usando ensaios de citotoxicidade in vivo.

Introduction

Células t CD8+ convencionais (tCD8) desempenham partes importantes na vigilância imune anticâncer. Eles funcionam principalmente na capacidade de linfócitos T citolíticos (CTLs) que reconhecem antígenos de peptídeos específicos do tumor ou associados (AGS) exibidos dentro da fenda fechada das moléculas de classe I do complexo de histocompatibilidade principal (MHC). CTLs totalmente armados utilizam seu arsenal citotóxico para destruir células malignas. O anticâncer TCD8 pode ser detectado na circulação ou mesmo dentro de massas primárias e metastáticas de muitos pacientes com câncer e animais portadores de tumor. No entanto, muitas vezes são anérgicos ou esgotados e não conseguem erradicar o cancro. Portanto, muitas modalidades imunoterapêuticas são projetadas para aumentar as frequências TCD8 anticâncer e para restaurar e impulsionar suas funções.

As proteínas tumorais abrigam muitos peptídeos, alguns dos quais podem ser imunogênicos e potencialmente imunoprotetores. Entretanto, as respostas TCD8 quantificáveis são eliciadas com magnitudes variáveis contra poucos peptídeos. Isso cria uma “hierarquia de imunodominância” entre os clones TCD8 1. Consequentemente, o imunodominante (ID) TCD8 ocupa fileiras hierárquicas proeminentes, que é julgada geralmente por sua abundância. Em contraste, células TCD8 cujo receptor de célula t (TCR) é específico para epítopos SUBDOMINANTES (DP) ocorrem em freqüências mais baixas. Nós e outros identificamos alguns dos fatores que ditam ou formam a imunodominância em respostas TCD8 . Estes incluem, entre outros, a modalidade da apresentação do AG ao TCD8 ingênuo (isto é, apresentação direta, Cruz-apresentação, cross-dressing)2,3,4, o tipo de pilhas AG-apresentando (APCs) participando da ativação TCD8 5, a abundância e estabilidade de proteínas AGS 6,7 e a eficiência e cinética de sua degradação por proteasomas7,8, o seletividade relativa do transportador associada ao processamento de AG (TAP) parapeptídeos9, a afinidade de peptídeos liberados para moléculas de MHC I9,10, a presença, as frequências precursoras e a diversidade de TCR de cognato tCD8 em pools de células t11,12,13, Cross-Competition entre as células t para acesso a APCs14,15, e a capacidade fratricida de TCD8 dos clones16. Além disso, a imunodominância TCD8 é submetida a mecanismos imunoregulatórios mediados por vários tipos de células supressoras, tais como células t regulatórias de ocorrência natural (ntreg)17, a molécula de superfície celular co-inibitória programada óbito-1 (PD-1)16, e certas enzimas intracelulares como a indolamina 2,3-dioxigenase (ido)18 e o alvo de mamíferos de rapamicina (mTOR)19. É importante notar, no entanto, que os fatores acima nem sempre respondem totalmente à imunodominância.

Aparte da biologia básica do immunodominance de TCD8 , a examinação deste fenômeno intrigante tem implicações importantes na imunologia e na imunoterapia do cancro. Primeiramente, um status da identificação não confere necessariamente em cima de um clone dado de TCD8 a habilidade de impedir a iniciação ou a progressão do tumor20. Se e como a identificação e o SD TCD8 contribuem à imunidade antitumoral podem depender do tipo e da extensão da malignidade e do sistema experimental empregado. Em segundo lugar, acredita-se que os clones de ID TCD8 podem ser “muito visíveis” para o sistema imunológico e, consequentemente,mais propensos a mecanismos de tolerância central e/ou periférica,16,21. Em terceiro lugar, os tumores heterogênicos podem conter as pilhas neoplásticas que evitam a deteção por muitos, se não a maioria, CTLs indicando somente um espectro estreito dos complexos do peptide: MHC. estas circunstâncias, as respostas de TCD8 da amplitude insuficiente são prováveis ter recursos para tais pilhas do tumor uma vantagem da sobrevivência, assim potenciando seu conseqüência22. É pelas razões acima que muitos a imunodominância da vista como um obstáculo ao sucesso TCD8-baseou a vacinação e as terapias de encontro ao cancro.

A inoculação de camundongos C57BL/6 com vírus Simian 40 (SV40)-células transformadas que expressam grande tumor AG (T AG) fornece um poderoso sistema pré-clínico para estudar imunodominância TCD8 . Este modelo oferece vários benefícios. Primeiramente, os epítopos peptídicos desta oncoproteína clinicamente relevante são bem caracterizados nesta cepa do camundongo23 (tabela 1). Segundo, os epítopos de T AG, que são chamados de sites I, II/III, IV e V, ativam as respostas TCD8 que são consistentemente organizadas na seguinte ordem hierárquica: site iv > > site i ≥ site II/iii > ≫ site V. consequentemente, o local IV específico tCD8 montar a resposta mais robusta para T AG. Em contrapartida, os sítios I e II/III são subdominantes, e o TCD8 específico do sítio V é menos abundante e geralmente apenas detectável na ausência de responsividade a outros epítopos23,24. Em terceiro lugar, a linha celular T AG+ tumoral utilizada no protocolo aqui descrito, ou seja, células fibrosarcoma C57SV, e aquelas utilizadas em nossas investigações prévias16, 17,18,19 ,25,26, são transformados com fragmentos de SV40 subgenômica25. Conseqüentemente, são incapazes de montar e liberar os virions SV40 que poderiam potencialmente infectar APCs do anfitrião. Além disso, as células C57SV são desprovidas de moléculas coestimulatórias clássicas como CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) e CD137 ligantes (4-1BBL)16. Os atributos acima tornam estas linhas ideais para o exame de in vivo TCD8 ativação via Cross-priming. O priming cruzado é um caminho importante na indução de respostas TCD8 , especialmente aquelas lançadas contra células tumorais de origem não hematopoiética que falham diretamente em Prime as células t ingênuas25.

As frequências e/ou funções antitumorais TCD8 podem ser monitoradas pela coloração de tetrâmero de MHC I, coloração intracelular para citocinas efetoras (por exemplo, interferão [IFN]-γ) ou moléculas líticas (por exemplo, perforina), ensaios imunoenzimáticos (ELISPOT) e ex ensaios de citotoxicidade vivo. Desde a sua criação nos anos 199027,28, carboxyfluoresceína éster succinimidil (CFSE)-com base em ensaios de matança in vivo permitiram a avaliação de respostas citotóxicas mediadas por CTLs antiviral29,30 , 31, CTLs antitumoral16,32, pilhas naturais do assassino (NK)33, pilhas naturais invariantes de glycolipid-reactivas do assassino T (iNKT)34, e preexistente e de novo doador-específico dos aloanticorpos26. Conseqüentemente, suas aplicações podem ser do interesse a um Readership largo, incluindo mas não limitado aos investigadores que trabalham nas áreas da imunologia do tumor e da imunoterapia, da imunidade do antipatógeno, e do projeto preventivo e terapêutico da vacina.

Para avaliar a citotoxicidade mediada por células em cenários típicos, duas populações de esplenócitos ingênuos que exibem um AG irrelevante ou um cognato AG (s) são rotulados com duas doses diferentes de CFSE, misturadas em números iguais e injetadas em ingênuo (controle) ou assassino ratos abrigando células. A presença/ausência de cada população-alvo é então examinada por citometria de fluxo.

Temos otimizado e empregado in vivo ensaios de matança em nossos estudos sobre imunodominância em ambas as respostas antiviral e antitumoral TCD8 12,16,17. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para a avaliação simultânea de respostas do ID e do SD TCD8 aos Epitopes de t AG, que podem prontamente ser adotados para investigações similares em outros sistemas experimentais. Nós igualmente fornecemos os resultados representativos que demonstram que o esgotamento da pilha de nTreg e o bloqueio PD-1 podem seletivamente realçar a citotoxicidadeCD8-induzida da identificação tCD8-e do SD t, respectivamente. No final, discutiremos várias vantagens de ensaios de matança in vivo, bem como algumas de suas limitações inerentes.

Protocol

Os experimentos aqui descritos seguem protocolos de uso animal aprovados por entidades institucionais e aderentes às diretrizes nacionais estabelecidas. 1. inoculação de C57BL/6 camundongos com T AG-expressando células tumorais Cresça a linha celular SV40 do fibrosarcoma C57SV (ou uma linha celular similar de T AG+ aderente) no meio modificado da águia de Dulbecco (DMEM) com 4,5 g/l D-glucose e l-Glutamine (1x) e suplementado com 1 milímetro piruvato de sódio e 10%…

Representative Results

O objetivo do experimento cujos resultados estão representados na Figura 1 foi determinar se a presença e as funções das células nTreg formam ou alteram a hierarquia de imunodominância de tCD8específico t AG. C57BL/6 camundongos foram injetados i.p. com PBS ou com 0,5 mgs de um CD25 mAb (clone PC-61.5.3 [PC61]) quatro dias antes de receberem 2 x 107 C57SV células tumorais i.p. Em experimentos separados, um controle de isotipo de rato IgG1 foi usado em vez de PBS…

Discussion

Os ensaios de citotoxicidade in vivo baseados em CFSE oferecem várias vantagens em relação aos ensaios de matança tradicionais, como o cromo radioativo (51CR) e os ensaios de liberação de lactato desidrogenase colorimétrica (LDH). Primeiramente, permitem a monitoração da função de CTL dentro de um órgão lymphoid secundário arquitetonicamente intacto.

Em segundo lugar, o assassinato específico de células-alvo em ensaios de citotoxicidade in vivo reflete o número abso…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo canadense institutos de pesquisa em saúde (CIHR) concede MOP-130465 e PJT-156295 para SMMH. JC é parcialmente apoiado por uma rainha Elizabeth II bolsa de pós-graduação em ciência e tecnologia do Ministério de formação, faculdades e universidades de Ontário. CEM foi um receptor de uma bolsa de pós-graduação Alexander Graham Bell Canada (doutorado) do Conselho de ciências naturais e engenharia de pesquisa do Canadá (NSERC).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA (1X) Thermo Fisher Scientific 25200-056
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher Scientific A1049201
Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3) Bio X Cell BE0012
Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14) Bio X Cell BE0146
CFSE Thermo Fisher Scientific C34554
DMEM (1X) Thermo Fisher Scientific 11965-092
Fetal bovine serum (FBS) Wisent Bioproducts 080-150 Heat-inactivate prior to use
GlutaMAX (100X) Thermo Fisher Scientific 35050-061
HEPES (1M) Thermo Fisher Scientific 15630080 10 mM final concentration
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)  Thermo Fisher Scientific 11140-050
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 Stock is 100X
Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2) SouthernBiotech 0116-01 Isotype control
Rat IgG1 (clone HRPN) Bio X Cell BE0088 Isotype control
Rat IgG1 (clone TNP6A7) Bio X Cell BP0290 Isotype control
Rat IgG2a (clone 2A3) Bio X Cell BP0089 Isotype control
RPMI 1640 (1X) Thermo Fisher Scientific 11875-093
Sodium Pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360-070 1 mM final concentration
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References

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In Vivo Cytotoxicity AssayTumor-specific CD8+ T Cell ResponsesImmunodominanceTumor AntigensCytotoxic T Cell ResponsesNK CellsInnate-like T LymphocytesAdherent Tumor Cell LineTarget Splenocyte PreparationC57BL/6 Mice

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Citer Cet Article
Choi, J., Meilleur, C. E., Haeryfar, S. M. Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses. J. Vis. Exp. (147), e59531, doi:10.3791/59531 (2019).
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