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Immunologie et infection

Adaptation des dosages de cytotoxicité in vivo à l’étude de l’immunodominance dans des réponses cellulaires spécifiques à la tumeur et aux lymphocytes T

Published: May 06, 2019
doi:
10.3791/59531
, ,
1Department of Microbiology and Immunology,Western University, 2Department of Medicine, Division of Clinical Immunology and Allergy,Western University, 3Department of Surgery, Division of General Surgery,Western University, 4Lawson Health Research Institute

Summary

Nous décrivons ici un essai de tuerie in vivo basé sur la cytométrie en flux qui permet l’examen de l’immunodominance dans les réponses cytotoxiques des lymphocytes T (CTL) à un antigène tumoral modèle. Nous fournissons des exemples de la façon dont ce dosage élégant peut être utilisé pour les études mécanistes et pour les tests d’efficacité des médicaments.

Abstract

Les dosages de cytotoxicité in vivo à base de carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) permettent une quantification sensible et précise des réponses de lymphocytes T cytolytiques (CTL) de la bactérie et des peptides dérivés de tumeurs et d’agents pathogènes. Ils offrent plusieurs avantages par rapport aux tests de tuerie traditionnels. Premièrement, ils permettent le suivi de la cytotoxicité médiée par la CTL au sein des organes lymphoïdes secondaires intacts architecturalement, généralement dans la rate. Deuxièmement, ils permettent des études mécanistiques pendant les phases d’amorçage, d’effecteur et de rappel des réponses CTL. Troisièmement, ils fournissent des plateformes utiles pour les tests d’efficacité des vaccins/médicaments dans un environnement véritablement in vivo. Ici, nous fournissons un protocole optimisé pour l’examen des réponses concomitantes de CTL contre plus d’un épitope de peptide d’un antigène de tumeur de modèle (AG), à savoir, le grand T AG (T AG) codé par le virus simien 40 (SV40). Comme la plupart des autres protéines tumorales cliniquement pertinentes, T AG héberge de nombreux peptides potentiellement immunogéniques. Cependant, seuls quatre de ces peptides induisent des réponses CTL détectables chez les souris C57BL/6. Ces réponses sont systématiquement disposées dans un ordre hiérarchique en fonction de leur magnitude, ce qui constitue la base de la «immunodominance» de T v dans ce système puissant. Par conséquent, la plus grande partie de la réponse T -t-t-t spécifique à t AG est centrée sur un seul épitope immunodominantes tandis que les trois autres épitopes sont reconnus et n’ont réagi que faiblement. L’immunodominance compromet l’ampleur des réponses antitumorales du T et est, en tant que telle, considérée par beaucoup comme un obstacle à la vaccination réussie contre le cancer. Par conséquent, il est important de comprendre les facteurs cellulaires et moléculaires et les mécanismes qui dictent ou forment l’immunodominance T. Le protocole que nous décrivons ici est adapté à l’étude de ce phénomène dans le modèle de vaccination de T AG, mais peut être facilement modifié et étendu à des études similaires dans d’autres modèles tumoraux. Nous fournissons des exemples de la façon dont l’impact des interventions immunothérapeutiques expérimentales peut être mesuré à l’aide de tests de cytotoxicité in vivo.

Introduction

Les cellules traditionnelles de l+ T(t) jouent des parties importantes dans la surveillance immunitaire anticancéreuse. Ils fonctionnent principalement dans la capacité des lymphocytes T cytolytiques (CTL) qui reconnaissent des antigènes peptidiques spécifiques ou associés à des tumeurs (AGS) affichés dans la fente fermée des molécules de classe I de complexe d’histocompatibilité majeure (MHC). Les CTL entièrement armés utilisent leur arsenal cytotoxique pour détruire les cellules malignes. L’anticancéreux T peut être détecté dans la circulation ou même à l’intérieur des masses primaires et métastatiques de nombreux patients cancéreux et animaux porteurs de tumeurs. Cependant, ils sont souvent anergiques ou épuisés et ne parviennent pas à éradiquer le cancer. Par conséquent, de nombreuses modalités immunothérapeutiques sont conçues pour augmenter les fréquences anticancéreuses du T et pour rétablir et renforcer leurs fonctions.

Les protéines tumorales abritent de nombreux peptides, dont certains peuvent être immunogènes et potentiellement immunoprotecteurs. Cependant, les réponses quantifiables de T-b sont obtenues avec des magnitudes variables par rapport à quelques peptides seulement. Cela crée une «hiérarchie d’immunodominance» parmi les clones T1. En conséquence, l’immunodominante (ID ) T s. v. occupent des rangs hiérarchiques importants, qui sont généralement jugés par leur abondance. En revanche, les cellules t, dont le récepteur de lymphocytes t (TCR) est spécifique pour les épitopes sous-dominants (SD), se retrouvent dans les fréquences inférieures. Nous et d’autres avons identifié certains des facteurs qui dictent ou façonnent l’immunodominance dans les réponses de T. Parmi ceux-ci figurent, entre autres, le mode de présentation AG à T (c.-à-d. présentation directe, Cross-Presentation, cross-dressing)2,3,4, le type de cellules présentatrices AG (APCS) participation à l’ activation5de T, l’abondance et la stabilité des protéines AGS6,7 et l’efficacité et la cinétique de leur dégradation par les protéasomes7,8, le sélectivité relative du transporteur associé au traitement AG (TAP) pour les peptides9, l’affinité des peptides libérés pour les molécules de MHC I9,10, la présence, les fréquences précurseurs et la diversité TCR des dans les pools de lymphocytes t11,12,13, la concurrence croisée entre les lymphocytes t pour l’accès aux APCS14,15et la capacité fratricide de t clones16. De plus, l’ immunodominance t-1 est soumise à des mécanismes immunologiques médiés par plusieurs types de cellules suppresseurs tels que les cellules t (ntreg) régulatrices naturelles17, la molécule co-inhibitrice de surface cellulaire programmée Death-1 (DP-1)16, et certaines enzymes intracellulaires telles que l’INDOLÉAMINE 2,3-dioxygénase (IDO)18 et l’objectif mammifère de la rapamycine (mTOR)19. Il est important de noter, cependant, que les facteurs ci-dessus ne représentent pas toujours pleinement l’immunodominance.

En dehors de la biologie de base de l’immunodominance T, l’examen de ce phénomène intrigant a des implications importantes dans l’immunologie et l’immunothérapie du cancer. Premièrement, un statut d’ID ne confère pas nécessairement à un clone T-1 donné la capacité de prévenir l’initiation ou la progression de la tumeur20. La question de savoir si et comment ID et SD T a contribuer à l’immunité antitumorale peut dépendre du type et de l’étendue de la malignité et du système expérimental utilisé. Deuxièmement, on pense que les clones ID T-1 peuvent être «trop visibles» pour le système immunitaire et par conséquent plus enclins aux mécanismes de tolérance centraux et/ou périphériques16,21. Troisièmement, les tumeurs hétérogéniques peuvent contenir des cellules néoplasiques qui évitent la détection par beaucoup, sinon la plupart, des CTL en affichant seulement un spectre étroit de peptide: complexes de MHC. Dans ces circonstances, les réponses de T. 5 de la largeur insuffisante sont susceptibles d’offrir à ces cellules tumorales un avantage de survie, potentiant ainsi leur excroissance22. C’est pour les raisons ci-dessus que de nombreux considèrent l’immunodominance comme un obstacleà la réussite de la vaccination basée sur T et des thérapies contre le cancer.

L’inoculation de souris C57BL/6 avec des cellules transformées de virus simien 40 (SV40) qui expriment une grande tumeur AG (T AG) fournit un système préclinique puissant pour étudier l’immunodominance de t. Ce modèle offre plusieurs avantages. Premièrement, les épitopes peptidiques de cette oncoprotéine cliniquement pertinente sont bien caractérisées dans cette souche de souris23 (tableau 1). Deuxièmement, les épitopes de T AG, qui sont appelés sites I, II/III, IV et V, déclenchent des réponses de T-b qui sont systématiquement disposées dans l’ordre hiérarchique suivant: site iv > > site i ≥ site II/iii > ≫ site v. en conséquence, le site IV spécifique t Montez la réponse la plus robuste à T AG. En revanche, les sites I et II/III sont sous-dominants, et le site V -specific T est moins abondant et n’est généralement détectable qu’en l’absence de réactivité à d’autres épitopes23,24. Troisièmement, la lignée de cellules tumorales T AG+ utilisée dans le protocole décrit ici, à savoir les cellules de Fibrosarcome C57SV, et celles utilisées dans nos enquêtes antérieures16,17,18,19 ,25,26, sont transformés avec des fragments de SV40 subgénomiques25. Par conséquent, ils ne peuvent pas assembler et libérer des virions SV40 qui pourraient potentiellement infecter les APCs d’hôte. En outre, les cellules C57SV sont dénuées de molécules costimulatrices classiques telles que CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) et CD137 ligand (4-1BBL)16. Les attributs ci-dessus font de ces lignes idéales pour l’examen de l’activation in vivo T par l’amorçage croisé. L’amorçage croisé est une voie majeure pour induire des réponses de T-b, en particulier celles lancées contre des cellules tumorales d’origine non hématopoïétique qui ne parviennent pas à amorcer directement les lymphocytes t naïfs25.

Les fréquences et /ou les fonctions de l’antitumorale T sont contrôlées par la coloration du tétramère MHC I, la coloration intracellulaire pour les cytokines effectrices (p. ex. interféron [IFN]-γ) ou les molécules lytiques (p. ex. perforine), les dosages d’immunospot (ELISPOT) enzymatiques et tests de cytotoxicité vivo. Depuis leur création dans les années 199027,28, la carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE)-essais de mise à mort in vivo ont permis l’évaluation des réponses cytotoxiques médiées par les CTL antiviraux29,30 , 31, antitumeur CTLS16,32, Natural Killer (NK) cellules33, glycolipidique invariant Natural Killer T (iNKT) cellules34, et préexistant et de Novo spécifique au donneur alloanticorps26. Par conséquent, leurs applications peuvent intéresser un large lectorat, y compris, mais sans s’y limiter, les enquêteurs travaillant dans les domaines de l’immunologie tumorale et de l’immunothérapie, l’immunité anti-pathogène, et la conception préventive et thérapeutique des vaccins.

Pour évaluer la cytotoxicité véhiculée par les cellules dans des scénarios typiques, deux populations de splénocytes naïfs qui présentent soit une AG non pertinente, soit une AG (s) apparentée, sont étiquetées avec deux doses différentes de CFSE, mélangées en nombres égaux et injectées dans des naïfs (témoins) ou des tueurs souris à l’herse cellulaire. La présence/absence de chaque population cible est ensuite examinée par cytométrie en flux.

Nous avons optimisé et utilisé des essais de mise à mort in vivo dans nos études sur l’immunodominance dans les réponses antivirales et anti-tumorales de T-112,16,17. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l’évaluation simultanée des réponses d’ID et de SD t de l’épitopes de t AG, qui peuvent être facilement adoptées pour des investigations semblables dans d’autres systèmes expérimentaux. Nous fournissons également des résultats représentatifs démontrant que la déplétion des cellules nTreg et le blocus de laDP-1 peuvent améliorersélectivement la cytotoxicité induite par l’ID t-t-T et le SD t-t. À la fin, nous discuterons de multiples avantages des essais de mise à mort in vivo ainsi que de certaines de leurs limitations inhérentes.

Protocol

Les expériences décrites ici suivent les protocoles d’utilisation des animaux approuvés par les entités institutionnelles et adhèrent aux lignes directrices nationales établies. 1. inoculation de souris C57BL/6 avec des cellules tumorales exprimant le T AG Cultiver la lignée de cellules de Fibrosarcome SV40 transformée C57SV (ou une lignée de cellules adhérentes T AG+ similaire) dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 4,5 g/l de D-glucose et d…

Representative Results

L’objectif de l’expérience dont les résultats sont décrits dans la figure 1 était de déterminer si la présence et les fonctions des cellules nTreg formaient ou modifiaient la hiérarchie de l’immunodominance de t s t AG spécifique. Des souris C57BL/6 ont été injectées i.p. avec PBS ou avec 0,5 mg d’un mAb anti-CD25 (clone PC-61.5.3 [PC61]) quatre jours avant de recevoir 2 x 107 C57SV cellules tumorales i.p. Dans des expériences distinctes, un contrôl…

Discussion

Les dosages de cytotoxicité in vivo basés sur le CFSE offrent plusieurs avantages par rapport aux essais de mise à mort traditionnels, tels que le chrome radioactif (51CR) et les essais de libération de la lactate déshydrogénase (LDH) colorimétrique. Premièrement, ils permettent le contrôle de la fonction CTL au sein d’un organe lymphoïde secondaire intact sur le plan architectural.

Deuxièmement, la mise à mort spécifique des cellules cibles dans les essais de cytotox…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été soutenus par les subventions MOP-130465 et PJT-156295 de la SMMH par les instituts de recherche en santé du Canada (IRSC). JC est partiellement appuyé par une bourse d’études supérieures de la Reine Elizabeth II en sciences et technologie du ministère de la formation, des collèges et des universités de l’Ontario. CEM a été récipiendaire d’une bourse d’études supérieures Alexander Graham Bell Canada (doctorat) du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA (1X) Thermo Fisher Scientific 25200-056
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher Scientific A1049201
Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3) Bio X Cell BE0012
Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14) Bio X Cell BE0146
CFSE Thermo Fisher Scientific C34554
DMEM (1X) Thermo Fisher Scientific 11965-092
Fetal bovine serum (FBS) Wisent Bioproducts 080-150 Heat-inactivate prior to use
GlutaMAX (100X) Thermo Fisher Scientific 35050-061
HEPES (1M) Thermo Fisher Scientific 15630080 10 mM final concentration
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)  Thermo Fisher Scientific 11140-050
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 Stock is 100X
Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2) SouthernBiotech 0116-01 Isotype control
Rat IgG1 (clone HRPN) Bio X Cell BE0088 Isotype control
Rat IgG1 (clone TNP6A7) Bio X Cell BP0290 Isotype control
Rat IgG2a (clone 2A3) Bio X Cell BP0089 Isotype control
RPMI 1640 (1X) Thermo Fisher Scientific 11875-093
Sodium Pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360-070 1 mM final concentration
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References

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In Vivo Cytotoxicity AssayTumor-specific CD8+ T Cell ResponsesImmunodominanceTumor AntigensCytotoxic T Cell ResponsesNK CellsInnate-like T LymphocytesAdherent Tumor Cell LineTarget Splenocyte PreparationC57BL/6 Mice

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Citer Cet Article
Choi, J., Meilleur, C. E., Haeryfar, S. M. Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses. J. Vis. Exp. (147), e59531, doi:10.3791/59531 (2019).
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