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Immunologie et infection

活体细胞毒性试验研究肿瘤特异性 CD8+ t 细胞反应中的免疫调节

Published: May 06, 2019
doi:
10.3791/59531
, ,
1Department of Microbiology and Immunology,Western University, 2Department of Medicine, Division of Clinical Immunology and Allergy,Western University, 3Department of Surgery, Division of General Surgery,Western University, 4Lawson Health Research Institute

Summary

我们这里描述了一种基于流式细胞仪的体内杀伤检测方法, 该方法能够检查细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 对模型肿瘤抗原的反应中的免疫调节。我们提供了如何将这种优雅的检测方法用于机械研究和药物疗效测试的示例。

Abstract

羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 (CFSE) 在体内细胞毒性检测, 使敏感和准确的定量 Cd8+细胞溶解 t 淋巴细胞 (ctl) 反应获得对肿瘤和病原源肽。与传统的杀虫检测相比, 它们具有几个优势。首先, 他们允许监测 ctl 介导的细胞毒性在建筑学完整的继发性淋巴器官, 通常在脾脏。其次, 它们允许在 CTL 响应的启动、效应和召回阶段进行机械研究。第三, 它们为在真正的体内环境中进行疫苗/药物药效检测提供了有用的平台。在这里, 我们提供了一个优化的方案, 用于检查伴随 CTL 响应的一个以上肽表位的模型肿瘤抗原 (Ag), 即 simian 病毒 40 (SV40) 编码大 T ag (T Ag)。与大多数其他与临床相关的肿瘤蛋白一样, T Ag 含有许多潜在的免疫原肽。然而, 只有四种此类肽可在 c57bl6 小鼠体内诱导可检测到的 CTL 反应。这些响应根据其大小一致地按层次顺序排列, 这构成了在这个强大的系统中 tCd8 “免疫调节” 的基础。因此, T ag 特异性 TCd8反应的大部分集中在单个免疫多瘤表位, 而其他三个表位被识别, 反应很弱。免疫调节损害了抗肿瘤 TCd8反应的广度, 因此被许多人认为是成功接种抗癌疫苗的障碍。因此, 了解决定或塑造Tcd8免疫调节的细胞和分子因素及其机制是非常重要的。我们在这里描述的协议是针对 T Ag 免疫模型中这一现象的研究量身定制的, 但可以很容易地修改和推广到其他肿瘤模型中的类似研究。我们提供了如何使用体内细胞毒性检测来衡量实验性免疫治疗干预措施的影响的例子。

Introduction

常规 CD8+ t 细胞 (t cd8) 在抗癌免疫监测中发挥着重要作用。它们主要在细胞分裂 t 淋巴细胞 (Ctl) 的能力, 识别肿瘤特异性或相关的肽抗原 (Ags) 显示在主要组织相容性复合体 (MHC) i 类分子的闭合裂隙中。全副武装的 Ctl 利用其细胞毒性武库来摧毁恶性细胞。抗癌 TCd8 可以检测到在循环中, 甚至在许多癌症患者和肿瘤动物的原发和转移性肿块内。然而, 它们往往是过敏或精疲力竭的, 无法根除癌症。因此, 许多免疫治疗方式旨在增加抗癌 TCd8频率, 并恢复和提高其功能。

肿瘤蛋白含有许多肽, 其中一些可以是免疫原性的, 并具有潜在的免疫保护。然而, 可量化的 TCd8 反应是以不同的大小获得的, 而只是对少数肽的反应。这在 TCd8克隆1之间创建了一个 “免疫调节层次结构“。因此, 免疫球蛋白 (ID)t Cd8 占据显著的等级等级, 这通常是由它们的丰度来判断的。相反, tCd8 细胞的 t 细胞受体 (tcr) 是特定的亚显性 (sd) 表位发生在较低的频率。我们和其他人已经确定了一些因素, 决定或塑造免疫调节在 TCd8反应。除其他外, 这些模式包括对天真的 tcd8的 ag 呈现模式 (即直接呈现、交叉呈现、变装)2、3、4、ag呈现细胞的类型 (apc)参与 tcd8活化5, 蛋白质 ags6,7的丰度和稳定性, 以及蛋白酶体 7,8,与 g 处理 (tap) 相关的转运体对9肽的相对选择性、mhc i 分子9、10的释放肽的亲和力、前体频率和 tcr 多样性。t 细胞池中的同源t cd8 11、12、13、t细胞之间在获得 apc14、15和 tcd8的骨形能力方面的交叉竞争克隆16。此外, TCd8免疫调节是由几种抑制细胞类型介导的免疫调节机制, 如自然发生的调节 t (nTreg) 细胞17, 细胞表面共抑制分子编程死亡-1 (PD-1)16, 以及某些细胞内酶, 如二氯胺酮 2, 3-二氧合酶 (ido ) 18 和雷帕霉素 (mtor)19的哺乳动物靶标。然而, 必须指出, 上述因素并不总是完全解释免疫调节。

除了 TCd8免疫调节的基本生物学外, 对这一有趣现象的检查对癌症免疫学和免疫治疗具有重要意义。首先, ID 状态不一定赋予给定的 TCd8克隆预防肿瘤开始或进展20的能力.ID 和 SDt Cd8 是否以及如何促进抗肿瘤免疫可能取决于恶性肿瘤的类型和程度以及所使用的实验系统。其次, 人们认为, idt cd8克隆可能对免疫系统 “太明显”, 因此更容易出现中央和/或外周耐受机制16,21。第三, 异基因肿瘤可能含有肿瘤细胞, 避免被许多 (如果不是大多数的话) Ctl 检测, 只显示狭窄的肽谱: MHC 复合物。在这种情况下, 宽度不足的 t Cd8反应可能会给这些肿瘤细胞提供生存优势, 从而增强其生长优势22。正是出于上述原因, 许多人认为免疫调节是成功的基于 TCd8的疫苗接种和抗癌治疗的障碍。

对 c57bl6 小鼠进行接种, 为 t cd8 免疫调节提供了一个强大的临床前系统, 该小鼠具有 simian 病毒 40 (Sv40) 转化细胞, 表达大肿瘤银 (t ag)。此模型提供了几个好处。首先, 这种临床相关的癌蛋白的肽表位在这个小鼠菌株23中有很好的特征 (表 1)。第二, T Ag 表位, 称为站点 I、II/iii、IV 和 V, 触发 T Cd8 响应, 这些响应一直按以下等级排列: 站点 IV > > 站点i≥ iiieiii > ≫ 站点 iii. 站点对 t ag 进行最稳健的响应。相反, 站点 i 和 ii/iii 是次优势的, 站点 v特异性 t cd8是最少的, 通常只有在对其他表位 23、24 没有响应的情况下才能检测到。第三, 本文所述协议中使用的 t ag+肿瘤细胞系, 即 c57sv 纤维肉瘤细胞, 以及我们以前的研究中使用的细胞 16、17、18、19 25, 26,用亚基因组 sv40 片段25转化.因此, 它们无法组装和释放可能感染宿主 Apc 的 SV40 病毒。此外, C57SV 细胞缺乏典型的共刺激分子, 如 CD80 (B7-1)、CD86 (B7-1) 和 CD137 配体 (4-1BBL)16。上述属性使这些线成为通过交叉启动检测体内 TCd8激活的理想之选。交叉预防是诱导 TCd8 反应的主要途径, 特别是那些针对非造血源肿瘤细胞启动的非造血源肿瘤细胞, 不能直接提供初级天真的 t 细胞25。

抗肿瘤t Cd8频率和/或功能可以通过 mhc i 四聚体染色、细胞内染色来监测效应细胞因子 (例如, 干扰素 [ifn]-γ) 或裂解分子 (例如, 穿孔)、酶联免疫罐 (elispot) 检测和体内细胞毒性检测。自 20世纪90年代成立以来,基于体内杀灭检测的羧荧光素琥珀酰酯 (cfse) 已经能够评估抗病毒 ctl 29, 30 介导的细胞毒性反应,31、抗肿瘤 ctls16,32, 自然杀伤细胞 (nk) 33, 甘油脂反应不变的自然杀手 t (inkt) 细胞34, 以及预先存在和新的捐献者特有的同种异体抗体26。因此, 它们的应用可能会引起广大读者的兴趣, 包括但不限于在肿瘤免疫学和免疫治疗、抗病原体免疫以及预防和治疗疫苗设计等领域工作的研究人员。

为了评估细胞介导的细胞毒性在典型的情况下, 两个群体的天真的脾细胞, 显示一个不相关的 Ag 或同源 Ag (s) 标记为两种不同剂量的 CFSE, 混合在相同的数量, 并注入天真 (控制) 或杀手细胞窝藏的老鼠。然后用流式细胞仪检查每个目标种群的存在情况。

在我们对抗病毒和抗肿瘤t cd8反应 12、16、17的免疫调节作用研究中, 我们在体内进行了优化和应用。在这里, 我们提供了一个详细的协议, 用于同时评估 ID 和 SDt Cd8对 t ag 表位的响应, 这可以很容易地用于其他实验系统中的类似调查。我们还提供了具有代表性的结果, 表明 nTreg 细胞消耗和 PD-1 封锁可以有选择地增强 ID TCd8-和 Sdt cd8诱导的细胞毒性, 分别。最后, 我们将讨论体内杀灭检测的多重优势以及它们的一些固有局限性。

Protocol

这里描述的实验遵循机构实体批准的动物使用规程, 并遵守既定的国家准则。 1. c57bl6 小鼠 t ag 表达肿瘤细胞的接种 在 Dulbecco 的改性 eagle 培养基 (dmem) 中, 用 4.5 gl d-葡萄糖和 l-谷氨酰胺( 1x), 在 dulbecco 的改性老鹰培养基 (dmem) 中生长 sv40 转化的纤维肉瘤细胞系 c57sv (或类似的 t ag + 粘附细胞系), 并补充 1 mm 的丙酮酸钠和10% 的热失活在含有 10% CO2 的加湿大气中, 37°…

Representative Results

如图 1所示, 实验的目的是确定 nTreg 细胞的存在和功能是否形成或改变 t Ag-t特 cd8的免疫调节层次结构。在 c57bl6 小鼠获得 2 x 10 c57sv 肿瘤细胞 (p. p.) 前四天, 用 PBS 或0.5 毫克抗 cd25 mAb (克隆 pc-61.5.3 [PC61]) 注射了 c57bl6 小鼠.在单独的实验中, 使用了大鼠 IgG1 同型对照代替 PBS。流式细胞仪检测成功 ntreg 细胞消耗的 Pc61。 C57SV …

Discussion

与传统的杀灭检测方法 (如放射性铬 (51cr) 释放和比色乳酸脱氢酶 (ldh) 释放检测) 相比, 基于 cfse 的体内细胞毒性检测具有多种优势。首先, 他们允许监测 CTL 功能在一个建筑完整的二级淋巴器官。

其次, 在体内细胞毒性检测中对靶细胞的特异性杀伤反映了 ag特异性 t Cd8的绝对数量, 这通常是但并不总是存在于脾脏中的 tcd8频率的功能。这与51Cr/ldh…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作得到了加拿大卫生研究所的支持, 向 SMMH 提供了 MOM-130465 和 PJT-156295。JC 得到安大略省培训、学院和大学部伊丽莎白二世科学和技术研究生奖学金的部分支持。CEM 是加拿大自然科学和工程研究理事会 (NSERC) 亚历山大·格雷厄姆·贝尔加拿大研究生奖学金 (博士) 的获得者。

Materials

0.25% Trypsin-EDTA (1X) Thermo Fisher Scientific 25200-056
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher Scientific A1049201
Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3) Bio X Cell BE0012
Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14) Bio X Cell BE0146
CFSE Thermo Fisher Scientific C34554
DMEM (1X) Thermo Fisher Scientific 11965-092
Fetal bovine serum (FBS) Wisent Bioproducts 080-150 Heat-inactivate prior to use
GlutaMAX (100X) Thermo Fisher Scientific 35050-061
HEPES (1M) Thermo Fisher Scientific 15630080 10 mM final concentration
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)  Thermo Fisher Scientific 11140-050
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 Stock is 100X
Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2) SouthernBiotech 0116-01 Isotype control
Rat IgG1 (clone HRPN) Bio X Cell BE0088 Isotype control
Rat IgG1 (clone TNP6A7) Bio X Cell BP0290 Isotype control
Rat IgG2a (clone 2A3) Bio X Cell BP0089 Isotype control
RPMI 1640 (1X) Thermo Fisher Scientific 11875-093
Sodium Pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360-070 1 mM final concentration
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References

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In Vivo Cytotoxicity AssayTumor-specific CD8+ T Cell ResponsesImmunodominanceTumor AntigensCytotoxic T Cell ResponsesNK CellsInnate-like T LymphocytesAdherent Tumor Cell LineTarget Splenocyte PreparationC57BL/6 Mice

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Citer Cet Article
Choi, J., Meilleur, C. E., Haeryfar, S. M. Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses. J. Vis. Exp. (147), e59531, doi:10.3791/59531 (2019).
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