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Immunologie et infection

Schneider In Vivo Cytotoxicity Assays zur Untersuchung von Immunodominanz in modularspezifischen CD8+ T Cell-Reaktionen

Published: May 06, 2019
doi:
10.3791/59531
, ,
1Department of Microbiology and Immunology,Western University, 2Department of Medicine, Division of Clinical Immunology and Allergy,Western University, 3Department of Surgery, Division of General Surgery,Western University, 4Lawson Health Research Institute

Summary

Wir beschreiben hier einen in vivo tötenden Assay basierenden Strömungszysam, der die Untersuchung der Immunodominanz in zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) auf ein Modell-Tumor-Antigen ermöglicht. Wir stellen Beispiele dafür zur Verfügung, wie dieser elegante Test für mechanistische Studien und für die Wirksamkeit von Medikamenten eingesetzt werden kann.

Abstract

Carboxyfluorescein suinimidyl ester (CFSE) auf Basis von vivo zytotoxicity-Assays ermöglichen eine sensible und genaue Quantifizierung von CD8+ zytolytischen T-Lymphozyten (CTL), die gegen Tumor-und pathogene Peptide ausgelöst werden. Sie bieten mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Tötungsuntersuchungen. Erstens erlauben sie die Überwachung der CTL-vermittelten Zytotoxizität innerhalb architektonisch intakter sekundärer Lymphorgane, typischerweise in der Milz. Zweitens ermöglichen sie mechanistische Studien während der Grundide-, Wirkungs-und Rückrufungsphasen der CTL-Reaktionen. Drittens bieten sie nützliche Plattformen für Impfungen bei der Wirksamkeit von Medikamenten in einer wahrhaft in vivo-Umgebung. Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll zur Untersuchung von begleiteten CTL-Antworten gegen mehr als ein Peptid-Ept eines Modelltumorantigen (Ag) zur Verfügung, nämlich das simianische Virus 40 (SV40)-kodiert großes T Ag (T Ag). Wie die meisten anderen klinisch relevanten Tumorproteine beherbergt T Ag viele potenziell immunogene Peptide. Allerdings führen nur vier solcher Peptide zu nachweisbaren CTL-Antworten bei C57BL-6-Mäusen. Diese Reaktionen sind konsequent in einer hierarchischen Reihenfolge angeordnet, die auf ihrer Größe basiert und die Grundlage für die “Immunodominanz” TCD8 in diesem mächtigen System bildet. Dementsprechend konzentriert sich der Großteil der T-Ag-spezifischen T CD8-Reaktion auf ein einzelnes immunominantes Epiope, während die anderen drei Epitope erkannt werden und nur schwach reagieren. Die Immunominanz beeinträchtigt die Breite der Antitumor-T-CD8-Reaktionen und wird als solche von vielen als Hindernis für eine erfolgreiche Impfung gegen Krebs angesehen. Daher ist es wichtig, die zellulären und molekularen Faktoren und Mechanismen zu verstehen, die die TCD8 -Immunodominanz diktieren oder formen. Das Protokoll, das wir hier beschreiben, ist auf die Untersuchung dieses Phänomens im T Ag-Immunisierungsmodell zugeschnitten, kann aber leicht modifiziert und auf ähnliche Studien in anderen Tumormodellen ausgeweitet werden. Wir stellen Beispiele dafür zur Verfügung, wie die Auswirkungen experimenteller immuntherapeutischer Eingriffe mit Hilfe von vivo Zytotoxizitätsuntersuchungen gemessen werden können.

Introduction

Herkömmliche CD8+ T-Zellen (TCD8) spielen wichtige Rollen in der antikantikanten Immunüberwachung. Sie funktionieren in erster Linie in der Kapazität von zytolytischen T-Lymphozyten (CTLs), die tumorspezifische oder-assoziierte Peptid-Antigene (Ags) erkennen, die innerhalb der geschlossenen Spalte der großen Histokompatibilitätskomplexen (MHC)-Klasse-I-Moleküle angezeigt werden. Voll bewaffnete CTLs nutzen ihr zytotoxisches Arsenal, um bösartige Zellen zu zerstören. Der Antikörper TCD8 kann im Kreislauf oder sogar in primären und metastasierenden Massen vieler Krebspatienten und tumortragenden Tieren nachgewiesen werden. Sie sind jedoch oft anergisch oder erschöpft und versäumen es, Krebs auszurotten. Daher sind viele immuntherapeutische Modalitäten so konzipiert, dass sie die T-CD8 -Frequenzen erhöhen und ihre Funktionen wiederherstellen und steigern.

Tumorproteine beherbergen viele Peptide, von denen einige immunogen und potenziell immunoprotektiv sein können. Allerdings werden quantifizierbare T CD8-Antworten mit unterschiedlichen Größenordnungen nur gegen wenige Peptide ausgelöst. Dadurch entsteht eine “Immunodominanz-Hierarchie” unter TCD8 Klonen1. Dementsprechend besetzen die immunodominanten (ID)T CD8 prominente hierarchische Ränge, die gemeinhin an ihrer Fülle gemessen werden. Im Gegensatz dazu treten T-CD8-Zellen, deren T-Zell-Rezeptor (TCR) spezifisch für subdominante (SD)-Epitope ist, in niedrigeren Frequenzen auf. Wir und andere haben einige der Faktoren identifiziert, die die Immunodominanz in den T-CD8-Reaktionen diktieren oder formen. Dazu gehören unter anderem der Modus der GB-Präsentation zu naivem TCD8 (z.B. direkte Präsentation, Cross-Präsentation, Cross-Dressing)2,3, 4,dieArt der Ag-präsentierenden Zellen (APCs) Die Teilnahme ander T CD8-Aktivierung5, die Fülle undStabilität des ProteinsAgs 6,7und die Effizienz und Kinetik ihrer Degradierung durch Proteasome 7,8,die Die relative Selektivität des Transporters, der mit der API-Verarbeitung (TAP) fürPeptide 9 verbunden ist, die Affinität der befreiten Peptide für MHC-I-Moleküle9, 10,die Anwesenheit, Vorläuferfrequenzen und die TCR-Vielfalt von CognateT CD8 in T-Zellpools 11,12, 13,Konkurrenzzwischen T-Zellen für den Zugang zu APCs14,15und die Bruderkapazität von T CD8 Klone16. Darüber hinaus wird die T CD8-Immunominanz von mehreren Suppressorzelltypen vermittelt, wie zum Beispiel den natürlich vorkommenden regulatorischen T (nTreg) Zellen17, dem koinhibitorischen Molekül der Zelloberfläche, programmiert Todes-1 (PD-1) 16, und bestimmte intrazelluläre Enzyme wie Indoleamin 2,3 Dioxygenase (IDO)18 und das Säugetierziel von Rapamycin (mTOR)19. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die oben genannten Faktoren nicht immer vollständig für die Immunominanz verantwortlich sind.

Neben der Grundbiologie der TCD8 -Immunodominanz hat die Untersuchung dieses faszinierenden Phänomens wichtige Auswirkungen auf die Krebs-Immunologie und Immuntherapie. Erstens verleiht ein ID-Status nicht unbedingt einem gegebenen T-CD8-Klon die Fähigkeit, Tumorinitiation oder Progression20zu verhindern. Ob und wie ID und SD TCD8 zur Antitumorimmunität beitragen, kann von der Art und dem Ausmaß der Bösartigkeit und dem verwendeten Versuchssystem abhängen. Zweitens wird angenommen, dass ID-T CD8-Klonefür das Immunsystem “zu sichtbar” sein können und daher anfälliger für zentrale and/oder periphere Toleranzmechanismen 16,21. Drittens können heterogene Tumoren neoplastische Zellen enthalten, die die Erkennung durch viele, wenn nicht sogar die meisten CTLs vermeiden, indem sie nur ein schmales Spektrum von Peptid-Komplexen anzeigen: MHC-Komplexe. Unter diesen Umständen dürften TCD8 -Reaktionen in unzureichender Breite solchen Tumorzellen einen Überlebensvorteil verschaffen und so ihr Auswachsen steigern 22. Aus den oben genannten Gründen sehen viele die Immunominanz als Hürde für eine erfolgreiche T-CD8-basierte Impfung und Therapie gegen Krebs.

Die Inokulation von C57BLACH 6 Mäuse mit Silavirus 40 (SV40)-transformierte Zellen, die großen Tumor Ag (T Ag) ausdrücken, bietet ein leistungsfähiges präklinisches System, um T CD8-Immunmodulare zu untersuchen. Dieses Modell bietet mehrere Vorteile. Zunächst sind die Peptid-Epitope dieses klinisch relevanten Onkoproteins in diesem Maus-Stamm23 gut charakterisiert (Tabelle 1). Zweitens, T Ag Epitope, die Standorte I, II/III, IV und V, Trigger TCD8 Antworten, die konsequent in der folgenden hierarchischen Reihenfolge angeordnet sind: Website IV > > Website I, Website I, Website > Website V> I. mounten Sie die robusteste Reaktion auf T Ag. Im Gegensatz dazu sind die Standorte I und II/III subdominant, und die standortV-spezifischen TCD8 sind am wenigsten vorhanden und in der Regel nur in Ermangelung der Reaktionsfähigkeitauf andere Epitope 23,24nachweisbar. Drittens, die T Ag+ Tumorzelllinie, die in dem hier beschriebenen Protokoll verwendet wird, nämlich die C57SV Fibrosarkom-Zellen,und die, die in unseren vorherigen Untersuchungen 16,17, 18,19verwendetwurden. ,25,26, werdenmit subgenomischen SV40-Fragmenten 25 verwandelt. Daher sind sie nicht in der Lage, SV40-Virions zu montieren und freizugeben, die möglicherweise Host-APCs infizieren könnten. Darüber hinaus sind die C57SV-Zellen frei von klassischen Costimulationsmolekülen wie CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) und CD137 ligand (4-1BBL)16. Die obigen Attribute machen diese Linien ideal für die Untersuchung der In-vivoT CD8-Aktivierung durch Cross-Priming. Cross-Priming ist ein wichtiger Weg, um TCD8 -Reaktionen zu induzieren, vor allem jene, die gegen Tumorzellen nichthämatopoetischen Ursprungs gestartet werden, die es nicht direktversäumen, die naiven T-Zellen direkt zu unterstützen.

Antitumor TCD8 Frequenzen and/oder Funktionen können durch MHC I Tetramer-Färbung überwacht werden, Intrazelluläre Färbung für Effektzytokine (z.B. Interferon [IFN]–oder lytische Moleküle (z.B. Perforin), enzymgebundene Immunospots (ELISpot) und Ex-Untersuchungen vivo zytotoxicity Assays. Seit ihrer Gründung in den 1990er Jahren von27, 28 Jahrenermöglichte Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) auf vivo-Totoring-Assays die Auswertung von zytotoxischen Reaktionen, die durch antivirale CTLs 29,30vermittelt wurden. , 31, Antitumor CTLs 16,32,Naturkiller (NK)Zellen 33, glykolipid-reaktive invariante Naturkiller T(iNKT) Zellen 34, und bereits vorhanden und de novo donor-spezifisch Legantikörper26. Daher können ihre Anwendungen für eine breite Leserschaft von Interesse sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Forscher, die in den Bereichen Tumorimmunologie und Immuntherapie, Anti-Erreger-Immunität und präventiven und therapeutischen Impfstoff-Design arbeiten.

Um die zellvermittelte Zytotoxizität in typischen Szenarien zu beurteilen, werden zwei Populationen naiver Splenozyten, die entweder eine irrelevante Ag oder ein kognates Ag (s) aufweisen, mit zwei verschiedenen Dosen CFSE gekennzeichnet, in gleicher Zahl gemischt und in naive (Kontrolle) oder Killer injiziert. Zellgehärtete Mäuse. Die Voraussetzung für das Fehlen jeder Zielpopulation wird dann durch die Strömungszytometrie untersucht.

Wir haben in unseren Studien zur Immunodominanz in antiviralen und antitumororartigen TCD8-Reaktionen 12,16, 17optimiert und in vivo-Tötungsuntersuchungeneingesetzt. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur gleichzeitigen Bewertung von ID-und SD T CD8-Antworten auf T Ag-Epitope zur Verfügung, das für ähnliche Untersuchungen in anderen Versuchssystemen problemlos übernommen werden kann. Darüber hinaus liefern wir repräsentative Ergebnisse, die zeigen, dass die NTreg-Zellabnahme und die PD-1-Blockade die ID-T-CD8-bzw. die SD-T-CD8-induzierte Zytotoxizität selektiv verbessern können. Am Ende werden wir mehrere Vorteile von in vivo Tötungsuntersuchungen sowie einige ihrer inhärenten Einschränkungen zu diskutieren.

Protocol

Die hier beschriebenen Experimente folgen Tierverbrauchsprotokollen, die von institutionellen Stellen genehmigt wurden und sich an die festgelegten nationalen Richtlinien hielten. 1. Inoculation von C57BL-6 Mäusen mit T Ag-ausdrückenden Tumorzellen Die SV40-verwandelte Fibrosarko-Zelllinie C57SV (oder eine ähnliche T Ag+ anhaftende Zelllinie) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 4,5 g/L D-Glukose und L-Glutamin (1x) und ergänzt mit 1 mM-Sodiumpyruvat und …

Representative Results

Ziel des Experiments, dessen Ergebnisse in Abbildung 1 abgebildet sind, war es, festzustellen, ob die Präsenz und die Funktionen von nTreg-Zellen die Immunodominanz-Hierarchie von T Ag-spezifischem TCD8formen oder verändern. C57BL/6 Mäuse wurden vier Tage vor dem Erhalt von 2 x 10 7 C57SV-Tumorzellen i.p. mit PBS oder mit 0,5 mg eines Anti-CD25 mAb (Klon PC- 61.5.3 [PC61]) injiziert. In separaten Experimenten wurde anstelle von PBS eine Ratte IgG1-Isotypenkontrolle e…

Discussion

CFSE-basierte in vivo Cytotoxicity-Assays bieten mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Tötungsuntersuchungen wie radioaktives Chrom (51Cr)-Freisetzung und farbimetrisches Laktat-Dehydrie-Dehydrogenase (LDH). Zunächst erlauben sie die Überwachung der CTL-Funktion innerhalb eines architektonisch intakten sekundären Lymphorgan.

Zweitens spiegelt die spezifische Tötung von Zielzellen in vivo zytotoxicity Assays die absolute Anzahl der Ag-spezifischen TCD8 wider, die…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von den kanadischen Instituten of Health Research (CIHR) unterstützt, die MOP-130465 und PJT-156295 an SMMH vergeben. JC wird teilweise von einem Queen Elizabeth II Graduate Stipendium in Wissenschaft und Technologie des Ministeriums für Ausbildung, Hochschulen und Universitäten in Ontario unterstützt. CEM erhielt ein Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship (doctoral) von Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA (1X) Thermo Fisher Scientific 25200-056
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher Scientific A1049201
Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3) Bio X Cell BE0012
Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14) Bio X Cell BE0146
CFSE Thermo Fisher Scientific C34554
DMEM (1X) Thermo Fisher Scientific 11965-092
Fetal bovine serum (FBS) Wisent Bioproducts 080-150 Heat-inactivate prior to use
GlutaMAX (100X) Thermo Fisher Scientific 35050-061
HEPES (1M) Thermo Fisher Scientific 15630080 10 mM final concentration
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)  Thermo Fisher Scientific 11140-050
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 Stock is 100X
Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2) SouthernBiotech 0116-01 Isotype control
Rat IgG1 (clone HRPN) Bio X Cell BE0088 Isotype control
Rat IgG1 (clone TNP6A7) Bio X Cell BP0290 Isotype control
Rat IgG2a (clone 2A3) Bio X Cell BP0089 Isotype control
RPMI 1640 (1X) Thermo Fisher Scientific 11875-093
Sodium Pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360-070 1 mM final concentration
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References

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Citer Cet Article
Choi, J., Meilleur, C. E., Haeryfar, S. M. Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses. J. Vis. Exp. (147), e59531, doi:10.3791/59531 (2019).
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