腫瘍特異的 CD8+ T 細胞応答における Immunodominance を研究するためのインビボ細胞毒性アッセイ
Summary
ここでは、モデル腫瘍抗原に対する細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) 応答における immunodominance の検査を可能にする、フローサイトメトリーベースのインビボ殺傷アッセイについて述べる。このエレガントなアッセイが、機械的な研究や薬効試験にどのように使用されるかの例を示します。
Abstract
Carboxyfluorescein succinimidyl エステル (CFSE)-インビボ細胞傷害性アッセイは、腫瘍および病原体由来ペプチドに対して惹起される CD8+細胞溶解 T リンパ球 (CTL) 応答の高感度かつ正確な定量を可能にする。従来の殺滅アッセイよりもいくつかの利点があります。第1に、それらは、構造的に無傷の二次的なリンパ系器官内の CTL 媒介性細胞毒性のモニタリングを可能にし、典型的には脾臓にある。第2に、それらは CTL 応答のプライミング、エフェクターおよびリコール段階における機械的な研究を可能にする。第三に、彼らは真の in vivo の設定でワクチン/薬効試験のための有用なプラットフォームを提供します。ここで、我々は、モデル腫瘍抗原 (Ag) の複数のペプチドエピトープに対する付随する CTL 応答の検査のために最適化されたプロトコルを提供し、即ち、シミアンウイルス 40 (SV40) −大 T Ag (T Ag) をコードした。他のほとんどの臨床的に関連した腫瘍蛋白質のように、T Ag は多くの潜在的に免疫原性ペプチドを港湾する。しかし、このようなペプチドは、C57BL/6 マウスにおいて検出できる CTL 応答を誘導するものは4つだけである。これらの応答は、その大きさに基づいて一貫して階層的に配列されており、この強力なシステムにおいて TCD8 「immunodominance」の基礎をなす。したがって、T Ag 特異的 TCD8応答の大部分は、単一の immunodominant エピトープに対して集束され、他方の3つのエピトープは認識され、弱くしか応答しない。Immunodominance は、抗腫瘍性 TCD8応答の幅を妥協し、癌に対する予防接種を成功させるための障害として多くの人に考えられています。したがって、TCD8 immunodominance を規定または形状する細胞および分子因子および機構を理解することが重要である。ここで述べるプロトコールは、T Ag 免疫モデルにおけるこの現象の調査に合わせたものであるが、他の腫瘍モデルにおいても同様の研究に容易に改変および拡張することができる。我々は、実験的免疫療法介入の影響が in vivo の細胞傷害性アッセイを使用して測定できる方法の例を提供する。
Introduction
従来の CD8+ T 細胞 (TCD8) は抗癌免疫監視において重要な部分を再生する。それらは主として、主要な組織適合性複合体 (MHC) クラス I 分子の閉鎖間隙内に表示される腫瘍特異的または関連するペプチド抗原 (Ags) を認識する細胞溶解 T リンパ球 (CTLs) の能力において機能する。完全に武装した CTLs は、細胞傷害性兵器庫を利用して悪性セルを破壊する。抗癌性 TCD8は、循環中に、あるいは多くの癌患者および腫瘍担持する動物の原発性および転移性の塊の中で検出することができる。しかし、彼らはしばしば anergic または枯渇し、癌の根絶に失敗します。したがって、多くの免疫療法モダリティは、抗癌 TCD8周波数を増加させ、それらの機能を回復し、後押しするように設計されています。
腫瘍タンパク質は多くのペプチドを immunoprotective し、そのうちのいくつかは免疫原性および潜在的に可能性がある。しかし、定量化可能な TCD8応答は、少数のペプチドに対してのみ様々な大きさで惹起される。これは、TCD8クローン1の間で「immunodominance 階層」を作成する。したがって、immunodominant (ID) TCD8は、顕著な階層ランクを占め、これは一般的にその豊かさによって判断される。対照的に、t 細胞受容体 (TCR) が音 (SD) エピトープに特異的である TCD8細胞は、より低い周波数で起こる。我々および他の人々は、TCD8応答において immunodominance を指示または形成するいくつかの因子を同定した。これらには、とりわけ、ナイーブ TCD8に対する Ag 提示のモード (すなわち、直接提示、クロスプレゼンテーション、クロスドレッシング)2、3、4、ag 提示細胞の種類 (apc)TCD8活性化5に参加して、タンパク質 Ags6,7の豊かさと安定性と、プロテアソーム7,8によるそれらの分解の効率および動態とを、ペプチド9の Ag 処理 (TAP) に関連するトランスポーターの相対選択性は、MHC I 分子9、10に対する遊離ペプチドの親和性、存在、前駆体頻度および TCR 多様性のt 細胞プール11、12、13における同族 tcd8 、apc14、15、および tCD8の fratricidal 能力にアクセスするための t 細胞間の交差競合クローン16加えて、TCD8 immunodominance は、天然に存在する調節性 t (nTreg) 細胞17などのいくつかのサプレッサー細胞型によって媒介される免疫調節機構を受け、細胞表面共阻害分子プログラム死− 1 (PD − 1)16、及び indoleamine 2、3−ジオキシゲナーゼ (イド)18及び哺乳動物用ラパマイシンの哺乳類標的 (mTOR) などの特定の細胞内酵素が19である。ただし、上記の要因が常に immunodominance を考慮しているわけではないことに注意することが重要です。
TCD8 immunodominance の基礎生物学とは別に、この興味深い現象の検査は、がん免疫学と免疫療法において重要な意味を持っています。第1に、ID ステータスは、必ずしも所与の TCD8クローンが腫瘍開始または進行20を予防する能力を与えるとは限らない。どのように、どのように ID と SD TCD8が抗腫瘍免疫に寄与するかは、悪性腫瘍の種類と程度、および使用される実験系に依存する可能性があります。第2に、ID TCD8クローンが免疫系に対して「あまりにも見えない」可能性があり、結果的に中枢および/または末梢寛容機構16,21になりやすいと考えられる。第3に、heterogeneic 腫瘍は、多くの場合には検出を回避する新生細胞を含んでいてもよく、ほとんどではないにしても、CTLs はペプチドの狭いスペクトルのみを表示することによって、MHC 複合体。これらの状況下では、不十分な幅の TCD8応答は、このような腫瘍細胞を生存の利点とする余裕があり、従ってそれらの伸長22を増強する。それは、多くの見方が、TCD8ベースのワクチン接種と癌に対する治療を成功させるためのハードルとして immunodominance ことである。
C57BL/6 マウスをサルウイルス 40 (SV40) で接種すると、大規模な腫瘍 Ag (T Ag) を発現する形質転換細胞は、TCD8 immunodominance を研究する強力な前臨床システムを提供する。このモデルは、いくつかの利点を提供します。第1に、この臨床的に関連するあるのペプチドエピトープは、このマウス株23においてよく特徴付けられる (表 1)。第二に、サイト I、II/III、IV、および V と呼ばれる T Ag エピトープは、以下の階層順序で一貫して配列されている TCD8応答をトリガします: サイト iv > > サイト I ≥サイト II/III > ≫ サイト V。したがって、サイト Iv 特異的 TCD8T Ag に最も堅牢な応答をマウントします。対照的に、部位 I および II/III は音であり、そして部位 V 特異的な TCD8は、少なくとも豊富であり、通常、他のエピトープ23、24に対する応答性がない場合にのみ検出可能である。第3に、本明細書に記載のプロトコールにおいて利用される T Ag+腫瘍細胞株、すなわち C57SV 線維肉腫細胞、およびこれまでの調査で用いられたものは16、17、18、19 、25、26、サブゲノミック SV40 フラグメント25で形質転換される。したがって、それらは、宿主 Apc に感染する可能性のある SV40 ビリオンをアセンブルおよび放出することができない。さらに、C57SV 細胞は、CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2)、および CD137 リガンド (4-1BBL)16などの古典的な増強分子を欠いている。上記の属性は、これらの線を交差プライミングによるインビボ TCD8活性化の検査に理想的にする。交差プライミングは、TCD8応答を誘導することにおける主要な経路であり、特に、直接素数 t 細胞25に失敗する非造血起源の腫瘍細胞に対して発射されるものである。
抗腫瘍性 TCD8の頻度および/または機能は、MHC I 四量体染色によってモニタリングすることができ、エフェクターサイトカインに対する細胞内染色 (例えば、インターフェロン [IFN]-γ) または溶菌分子 (例えば、パーフォリン)、酵素結合 Immunospot (ELISpot) アッセイおよび exインビボ細胞傷害性アッセイ。1990年代に開始されて以来、27,28, carboxyfluorescein succinimidyl エステル (CFSE)-インビボで殺害アッセイは、抗ウイルスによって媒介される細胞傷害性応答の評価を可能にした CTLs29,30,31、抗腫瘍性 CTLs16、32、ナチュラルキラー (NK) 細胞33、糖脂質反応性不変のナチュラルキラー T (iNKT) 細胞34、および、既存および de novo ドナー特異的同種抗体26。したがって、それらのアプリケーションは、腫瘍免疫学および免疫療法、抗病原体免疫、および予防および治療ワクチン設計の分野で働く研究者を含むが、これらに限定されない幅広い読者にとって興味深いものとなり得る。
典型的なシナリオにおける細胞媒介性細胞毒性を評価するために、無関係な Ag または同族 Ag のいずれかを表示するナイーブ脾細胞の2つの集団は、CFSE の2つの異なる用量で標識され、等しい数で混合し、ナイーブ (コントロール) またはキラーに注入する細胞を宿すマウス。次に、各ターゲット母集団の有無がフローサイトメトリーによって検査されます。
我々は、抗ウイルスおよび抗腫瘍性 TCD8応答の両方における immunodominance に関する研究において、最適化されており、インビボ殺害アッセイを行った12、16、17。ここでは、ID および SD TCD8応答の同時評価のための詳細なプロトコールを、他の実験系における同様の調査のために容易に採用することができる t Ag エピトープに提供する。我々はまた、nTreg 細胞枯渇および PD-1 遮断が、それぞれ ID Tcd8-および SD Tcd8誘発性細胞毒性を選択的に増強できることを示す代表的な結果を提供する。最後に、in vivo での殺滅アッセイとその固有の制限について、複数の利点について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
CFSE ベースの細胞傷害アッセイは、放射性クロム (51Cr) 放出および比色乳酸脱水素酵素 (LDH) 放出アッセイなどの従来の殺滅アッセイに比べていくつかの利点を提供する。第1に、構造的に無傷な二次リンパ器官内での CTL 機能のモニタリングを可能にする。
第2に、インビボ細胞傷害性アッセイにおける標的細胞の特異的殺傷は、Ag 特異的 Tcd8の絶対数を反?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、カナダ医療研究機関 (CIHR) 助成金130465と PJT-156295 によってサポートされました SMMH。JC さんは、オンタリオ州の研修、大学、大学から科学技術分野の研究者であるクイーン・エリザベス二世によって部分的に支持されています。CEM は、カナダの自然科学および工学研究評議会 (NSERC) からアレクサンダー・グラハム・ベル・カナダ奨学生 (博士) の受賞者でした。
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3) | Bio X Cell | BE0012 | |
| Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14) | Bio X Cell | BE0146 | |
| CFSE | Thermo Fisher Scientific | C34554 | |
| DMEM (1X) | Thermo Fisher Scientific | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Bioproducts | 080-150 | Heat-inactivate prior to use |
| GlutaMAX (100X) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | 10 mM final concentration |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Stock is 100X |
| Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2) | SouthernBiotech | 0116-01 | Isotype control |
| Rat IgG1 (clone HRPN) | Bio X Cell | BE0088 | Isotype control |
| Rat IgG1 (clone TNP6A7) | Bio X Cell | BP0290 | Isotype control |
| Rat IgG2a (clone 2A3) | Bio X Cell | BP0089 | Isotype control |
| RPMI 1640 (1X) | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | 1 mM final concentration |
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