Summary
Décrit ici est un protocole pour étudier les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain utilisant des systèmes de fermentation in vitro de lot.
Abstract
Les micro-organismes intestinaux humains sont récemment devenus une cible importante de la recherche dans la promotion de la santé humaine et la prévention des maladies. Par conséquent, les études sur les interactions entre les endobiotiques (p. ex., les médicaments et les prébiotiques) et le microbiote intestinal sont devenues un sujet de recherche important. Cependant, les expériences in vivo avec des volontaires humains ne sont pas idéales pour de telles études en raison de la bioéthique et des contraintes économiques. En conséquence, des modèles animaux ont été utilisés pour évaluer ces interactions in vivo. Néanmoins, les études de modèles animaux sont encore limitées par des considérations de bioéthique, en plus de compositions et de diversités différentes du microbiote chez les animaux par rapport aux humains. Une autre stratégie de recherche est l'utilisation d'expériences de fermentation par lots qui permettent d'évaluer les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal in vitro. Pour évaluer cette stratégie, les exopolysaccharides bifidobactériens (Bif) ont été utilisés comme xénobiotique représentatif. Ensuite, les interactions entre Bif EPS et le microbiote intestinal humain ont été étudiées à l'aide de plusieurs méthodes telles que la chromatographie à couches minces (TLC), l'analyse compositionnelle de la communauté bactérienne avec le séquençage à haut débit du gène rRNA 16S et la chromatographie gazeuse. d'acides gras à chaîne courte (SCFA). Présenté ici est un protocole pour étudier les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain à l'aide de systèmes de fermentation par lots in vitro. Fait important, ce protocole peut également être modifié pour étudier les interactions générales entre d'autres endobiotiques et le microbiote intestinal.
Introduction
Le microbiote intestinal joue un rôle important dans le fonctionnement des intestins humains et dans la santé de l'hôte. Par conséquent, le microbiote intestinal est récemment devenu une cible importante pour la prévention et la thérapie des maladies1. En outre, les bactéries intestinales interagissent avec les cellules intestinales hôtes et régulent les processus fondamentaux de l'hôte, y compris les activités métaboliques, les disponibilités nutritives, la modulation du système immunitaire, et même la fonction cérébrale et la prise de décision2,3 . Les endobiotiques ont un potentiel considérable pour influencer la composition bactérienne et la diversité du microbiote intestinal. Ainsi, les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain ont attiré l'attention croissante de la recherche4,5,6,7,8,9.
Il est difficile d'évaluer in vivo les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain en raison de la bioéthique et des contraintes économiques. Par exemple, des expériences sur les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain ne peuvent être réalisées sans la permission de la Food and Drug Administration, et le recrutement de volontaires coûte cher. Par conséquent, les modèles animaux sont souvent utilisés pour de telles enquêtes. Cependant, l'utilisation de modèles animaux est limitée en raison de différentes compositions de microbiotes et de la diversité dans les communautés associées aux animaux par rapport à l'homme. Une autre méthode in vitro pour explorer les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain est l'utilisation d'expériences de culture par lots.
Les exopolysaccharides (EPS) sont des prébiotiques qui contribuent de manière significative au maintien de la santé humaine10. Les EPS distincts qui se composent de différentes compositions et structures monosaccharides peuvent présenter des fonctions distinctes. Des analyses antérieures ont déterminé la composition des EPS Bif, qui sont le xénobiotique représentatif visé dans la présente étude11. Cependant, les effets métaboliques associés à l'hôte n'ont pas été pris en considération en ce qui concerne la composition et la diversité de l'EPS.
Le protocole décrit ici utilise le microbiote fécal de 12 volontaires pour fermenter les EPS Bif. La chromatographie à couches minces (TLC), le séquençage à haut débit du gène 16S rRNA et la chromatographie gazeuse (GC) sont ensuite utilisés en combinaison pour étudier les interactions entre les SPE et le microbiote intestinal humain. Les avantages distincts de ce protocole par rapport aux expériences in vivo sont son faible coût et l'évitement des effets d'interférence du métabolisme de l'hôte. En outre, le protocole décrit peut être utilisé dans d'autres études qui étudient les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain.
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Protocol
Ce protocole suit les lignes directrices du comité d'éthique de l'Université des sciences et de l'ingénierie du Hunan (Hunan, Chine) et de l'Université Zhejiang Gongshang (Zhejiang, Chine).
1. Préparation des bactéries
- Préparation du bouillon bifidobacterium moyen
- Mélanger les composants suivants dans 950 ml d'eau distillée : extrait de viande, 5 g/L; extrait de levure, 5 g/L; peptone de caséine, 10 g/L; soytone, 5 g/L; glucose, 10 g/L; K2HPO4, 2,04 g/L; MgSO47H2O, 0,22 g/L; MnSO4. H20, 0,05 g/L; NaCl, 5 g/L; Entre-4 80, 1 ml; solution de sel, 40 mL (CaCl2.2H2O, 0,25 g/L; KH2PO4, 1 g/L; NaHCO3, 10 g/L; NaCl, 2 g/L); et la résine, 0,4 ml (2,5 mg/L). Ajuster le pH à 6,8 avec 2 M NaOH.
- Autoclave à 121 oC pendant 15 min et laisser refroidir le bouillon à température ambiante (RT) dans des conditions anaérobies (10 % H2, 10 % CO2, 80 % N2). Ajouter la cystéine-HCl stérilisée par filtre (0,5 g/L) et la mupirocine (5 mg/L) au milieu.
- Ajouter un aliquot (50 l) de Bifidobacterium longum congelé à un tube de culture avec 5 ml de bouillon bifidobacterium moyen dans des conditions anaérobies, puis la culture dans un incubateur anaérobie pendant 24 h à 37 oC.
2. Préparation des EPS bifidobactériens
- Préparation du milieu d'agar PYG
- Combiner ce qui suit : peptone, 20 g/L; extrait de levure, 10 g/L; glucose, 5 g/L; NaCl, 0,08 g/L; CaCl2, 0,008 g/L; MgSO47H2O, 0,008 g/L; K2HPO4, 0,04 g/L; KH2PO4, 0,04 g/L; NaHCO3, 0,4 g/L; agar, 12 g/L. Ajuster le pH à 7,2 à l'aide de 10 M NaOH.
- Autoclave zèle le support à 121 oC pendant 15 min et refroidissez-le à 50 oC. Puis, par 1 L de milieu, ajouter 0,5 mL de vitamine K1 stérolisée par filtre (1 g de vitamine K1 dissous en 99 ml d'éthanol à 99 %), 5 mL de solution d'hémin (0,5 g d'hémindin dissous en 1 ml de 1 mol/L NaOH , a ensuite apporté jusqu'à 100 ml avec de l'eau distillée), et 0,5 g de cystéine-HCl.
- Avant de verser les plaques PYG, ajouter les plaques PYG stérilisées 5-bromo-4-chloro-3-indolylMD-D-galactopyranoside (X-Gal, 0,06 g/L), LiCl-3H2O (5,7 g/L) et mupirocin (5 mg/L) au milieu.
REMARQUE : X-Gal et LiCl.3H2O permettent l'identification des colonies de Longum de B. sur des plaques par des changements de coloration.
- Inoculer 20 oL de souches de B. longum (étape 1.2) aux plaques PYG et placer dans un incubateur anaérobie à 37 oC pendant 72 h.
- Recueillir les colonies bactériennes mucoïdes des plaques PYG à l'aide d'une pelle de pesage, puis resuspendre complètement dans 10 ml de saline tamponnée de phosphate (PBS) à l'aide d'un oscillateur vortex.
REMARQUE : Les mélanges bactériens et EPS doivent être complètement suspendus par le vortex ingou vers le haut ou le tuyautt de haut en bas à plusieurs reprises jusqu'à ce que les fibres soient complètement dissous dans PBS. - Centrifugelant la suspension à 6 000 x g pendant 5 min.
- Transférer soigneusement les supernatants dans un nouveau tube de centrifugeuse et mélanger complètement avec trois volumes d'éthanol froid à 99 % par inversion et mélange répétés.
- Centrifuger le mélange à 6 000 x g pendant 5 min et retirer complètement les supernatants.
- Retirer les précipités des tubes de centrifugeuse en grattant et en séchant les extraits d'EPS pendant la nuit à l'aide d'un aspirateur de vitesse.
3. Préparation du milieu de fermentation
- Préparation de la culture de base moyen VI
- Combiner ce qui suit : peptone, 3 g/L; tryptone, 3 g/L; extrait de levure, 4,5 g/L; mucine, 0,5 g/L; sels de bile no 3, 0,4 g/L; NaCl, 4,5 g/L; KCl, 2,5 g/L; MgCl26H2O, 4,5 g/L; 1 mL Tween 80; CaCl2.6H2O, 0.2 g/L; KH2PO4, 0,4 g/L; MgSO47H2O, 3,0 g/L; MnCl24H2O, 0,32 g/L; FeSO47H2O, 0,1 g/L; CoSO47H2O, 0,18 g/L; CaCl2H2O, 0,1 g/L; ZnSO47H2O, 0,18 g/L; CuSO45H2O, 0,01 g/L; et NiCl2x 6H2O, 0,092 g/L. Ajuster le pH à 6,5 avec 1 M HCl.
- Préparer l'hémine et la cystéine comme fait dans la section 2.1 et ajouter après l'autoclacage et le refroidissement.
- Préparer des supports culturels qui contiennent différentes sources de carbone avec un média de base VI. Avant l'autoclacnage, ajouter 8 g/L de fibres Bif EPS à un VI moyen, comprenant le groupe VI-Bif. De plus, ajoutez 8 g/L d'amidon à un ive moyen pour représenter le groupe VI-Starch. Enfin, le moyen VI sans ajout d'une source de carbone est utilisé comme contrôle (groupe VI).
REMARQUE : Le Bif EPS et l'amidon sont d'abord dissous dans l'eau chaude à l'aide d'un agitateur magnétique, puis mélangés à un milieu VI préparé. - Autoclave tous les médias à 121 oC pendant 15 min et laisser refroidir à RT.
- Transférer un sous-échantillon (5 ml) de chaque milieu dans des tubes de culture dans un incubateur anaérobie, et conserver le support restant à 4 oC.
4. Préparation d'échantillons fécaux humains
- Recueillir des échantillons de matières fécales fraîches immédiatement après la défécation fraîche de volontaires humains adultes en bonne santé à l'aide de récipients d'excréments, et ensuite utiliser pour la préparation de boue.
REMARQUE : Avant la collecte de l'échantillon, tous les volontaires devraient subir un dépistage afin de s'assurer qu'ils ne reçoivent pas d'antibiotiques, de probiotiques ou de traitements prébiotiques pendant au moins 3 mois avant de donner des échantillons. De plus, tous les donateurs doivent fournir un consentement éclairé et écrit. - Transférer un échantillon fécal frais (1 g) à 10 ml de 0,1 M DE PBS anaérobie (pH 7,0) dans des béchers en verre, puis utiliser des tiges de verre pour préparer une boue de 10 % (w/v).
- Utilisez un tamis de 0,4 mM pour filtrer la boue fécale. Ensuite, utilisez un sous-échantillon de la boue filtrée pour inoculer les expériences de fermentation de la culture par lots, et entreposez le reste à -80 oC pour d'autres analyses.
REMARQUE : Les étapes 4.2-4.3 sont effectuées dans une chambre anaérobie.
5. Fermentation par lots in vitro
- Ajouter la boue fécale filtrée (500 l) au milieu de fermentation préparé à l'étape 3.2 dans une chambre anaérobie, puis incuber à 37 oC.
- Recueillir 2 ml d'échantillons fermentés à 24 h et 48 h dans la chambre anaérobie, puis centrifuger à l'extérieur de la chambre à 6 000 x g pendant 3 min.
- Transférer soigneusement les supernatants dans un nouveau tube de centrifugeuse qui sera utilisé pour l'analyse de la dégradation des polysaccharides et les mesures des acides gras à chaîne courte (SCFA).
- Entreposer les granulés de centrifugation à -80 oC et les utiliser par la suite pour l'extraction de l'ADN génomique bactérien.
6. Dégradation de l'EPS par le microbiote fécal humain
- Chargez 0,2 L de supernatants fermentés sur des plaques d'aluminium en silice pré-enduite 60 TLC, puis séchez à l'aide d'un sèche-cheveux.
- Développer les plaques dans 20 ml d'un acide formique / n-butanol / eau (6:4:1, v:v:v) solution et sécher à l'aide d'un sèche-cheveux.
- Faire tremper les assiettes dans le réactif orcinol pour les colorer, puis sécher à l'aide d'un sèche-cheveux.
- Préparer les réactifs orcinol en dissolvant 900 mg de Lichenol dans 25 ml d'eau distillée, puis en ajoutant 375 ml d'éthanol. Par la suite, l'acide sulfurique concentré devrait être lentement ajouté et la solution complètement mélangée.
- Chauffer les plaques à 120 oC pendant 3 min dans un four à pâtisserie et évaluer la dégradation de l'EPS en mesurant les bandes de TLC.
7. Effets de l'EPS sur le microbiote intestinal humain
- Décongeler-décongeler les échantillons fécaux originaux préparés à l'étape 4.3 et les échantillons fermentés préparés à l'étape 5.4.
- Extraire l'ADN génomique bactérien (ADNG) de tous les échantillons à l'aide d'une trousse d'extraction d'ADN génomique bactérien des selles suivant les instructions du fabricant.
- Déterminer les concentrations d'ADN, les intégrosités et les distributions de taille à l'aide d'un micro-spectrophotomètre et d'une électrophorèse de gel d'agar.
- Conduisez PCR des gènes bactériens 16S rRNA de l'ADNc extrait à l'aide des amorces avant et inverses décrites précédemmentprécédemment 12:
- Amorce avant (amorce à code à barres 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCACA
-amorce inversée (806R): GGACTACHVGGGTWTCTAAT
Utilisez les conditions suivantes :- 94 oC pendant 5 min.
- 94 oC pour 30 s.
- 55 oC pour 30 s.
- 72 oC pour 1 min.
- Répéter 2 à 4 pendant 35 cycles
- 72 oC pendant 5 min.
- 4 oC jusqu'à l'enlèvement du cycleur thermique.
- Effectuer un séquençage à haut débit des produits PCR dans une entreprise de séquençage de l'ADN à l'aide d'une analyse communautaire microbienne à très haut débit.
- Obtenir des séquences propres et de haute qualité à l'aide du pipeline d'analyse de séquences13.
- Définir les unités taxonomiques opérationnelles (OTUs) pour les séquences de gènes 16S rRNA avec plus de 97% de similitude nucléotide à l'aide d'outils bioinformatiques tels que la suite logicielle Mothur14.
- Choisissez une séquence représentative de chaque OTU et utilisez le classificateur RDP avec la base de données taxonomique SILVA pour classer les séquences représentatives15.
- Calculer la couverture de Good, les mesures de la diversité alpha (y compris l'indice Simpson et Shannon) et la richesse (nombre observé d'OTUs) à l'aide d'outils de bioinformatique16.
8. Effets de l'EPS sur la production de SCFA par microbiote intestinal humain
- Ajouter les supernatants fermentés (1 ml) préparés à l'étape 5,3 à 2 ml de tubes centrifugeurs.
- Ajouter 0,2 ml d'acide métaphosphorique de 25 % (w/v) à chacun des échantillons et mélanger soigneusement les solutions par vortex.
- Centrifuger les mélanges à 13 000 x g pendant 20 min et transférer les supernatants dans des tubes frais.
- En même temps, préparez des solutions de 120 mM d'acides acétiques, propioniques, butyriques, isobutyriques, valeriques et isovaleric. Ensuite, ajouter 1 ml de chaque acide préparé à 1,2 ml de 25 % (w/v) d'acide métaphosphorique et utiliser comme cocktails standard.
- Filtrer les échantillons à l'aide d'une membrane de 0,22 M.
- Détecter les concentrations de SCFA à l'aide d'une chromatographie gazeuse de haute performance selon les protocoles précédemment décrits11,17.
REMARQUE : Une colonne InertCap FFAP (0,25 mM x 30 m x 0,25 M) est utilisée pour la chromatographie gazeuse (GC). Les concentrations de SCFA sont ensuite quantifiées en fonction des zones de pointe en utilisant la méthode standard interne à un seul point dans le logiciel GC Solution.
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Representative Results
La production d'EPS mucoid a pu être observée dans les cultures De B. longum sur les plaques PYG après incubation anaérobie pendant 72 h (figure 1A). La centrifugation des égratignures de culture, suivie des précipitations et du séchage de l'éthanol, a donné lieu à la collecte d'EPS semblables à la cellulose (figure 1B). L'EPS séché et l'amidon soluble ont ensuite été utilisés comme sources de carbone pour les cultures de fermentation. TLC a été utilisé pour l'analyse de séparation et de pureté de l'oligosaccharide en raison de son faible coût et de son redressement rapide des résultats18. Bien que le taux de dégradation de l'amidon par le microbiote fécal humain ait été plus rapide que celui du Bif EPS (figure 2), la dégradation de l'EPS de Bif a été clairement observée pour certains échantillons inoculés par LE SPE.
L'analyse compositionnelle de la communauté par l'intermédiaire du séquençage à haut débit du gène 16S et de l'analyse de la coordination principale (PCoA) a ensuite été effectuée pour étudier les effets du SPE Bif sur le microbiote intestinal humain. Des échantillons provenant des groupes VI-Bif et VI-Starch se sont regroupés séparément les uns des autres dans l'analyse PCoA (Figure 3A), indiquant que la disponibilité de l'EPS et de l'amidon façonne différentiellement les communautés bactériennes fécales humaines. La taille linéaire de l'effet d'analyse de discriminant (LEfSe) a été également utilisée pour distinguer les taxons bactériens spécifiques qui différaient entre les traitements VI-Bif et VI-Starch. Les genres Collinsella, Coprococcus, Parabacteroides, et Rhodopseudomonas étaient significativement plus abondants dans les échantillons de VI-Bif que dans les échantillons vi-starch (figure 3B). En outre, des mesures GC ont été effectuées pour plusieurs SCFA afin d'évaluer leur production après l'ajout de différentes sources de carbone. Les SCFA qui ont été mesurés à partir des cultures de fermentation ont inclus les acides acétiques, propionic, isobutyric, butyric, isovaleric, et valeric. Après fermentation de 24 h et 48 h, cinq des six concentrations susmentionnées de SCFA étaient similaires parmi les traitements et non statistiquement différentes entre les groupes VI-Bif, VI-Starch et VI. Cependant, les concentrations d'acide propionique étaient significativement plus élevées dans le groupe VI-Bif que dans le groupe VI-Starch (figure 4).
Figure 1 : EPS produit par B. longum.
Le longum congelé B. a été restauré dans le bouillon moyen de Bifidobacterium, puis strié sur des plaques PYG, suivi d'une incubation anaérobie à 37 oC pendant 72 h (A). L'EPS produit par les cultures bactériennes ont été grattés à partir de cultures de plaques, précipités à l'aide d'éthanol, et séchés pendant la nuit à l'aide d'un aspirateur de vitesse (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Analyse TLC de l'EPS in vitro et de la dégradation de l'amidon par microbiote intestinal humain.
L'analyse de TLC a été effectuée sur des échantillons de 0,2 L prélevés à 24 h et 48 h de chaque culture de fermentation cultivée dans des conditions anaérobies. VI, VI-Starch, et VI-Bif indiquent VI médias, VI médias - supplément d'amidon, et VI médias - supplément EPS, respectivement. Les nombres 1-12 indiquent des échantillons bactériens fécaux des 12 volontaires qui ont été utilisés pour inoculer les expériences de fermentation. Le groupe témoin représente le traitement sans suppléments de carbone supplémentaires. Ce chiffre est modifié à partir de Yin et al. 11. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Effets de la disponibilité du SPE DeF sur les communautés humaines de microbiote intestinal.
(A) PCoA parcelle de l'intestin microbiote communauté dissemblances compositionnelle basée sur la métrique UniFrac non pondérée. (B) Analyse LEfSE des taxons bactériens qui étaient différentiellement abondants parmi les groupes de traitement. Une coupure de p 'lt; 0.05 a été utilisée pour évaluer la signification statistique des différences taxonomiques bactériennes entre les groupes. Ori indique le microbiote intestinal des échantillons fécaux volontaires. Vi-Bif et VI-Starch indiquent le microbiote intestinal à partir d'échantillons de fermentation utilisant des supports VI avec EPS et amidon comme substrats de carbone, respectivement. VI représente le groupe témoin avec des fermentations inoculées par microbiote intestinal dans les médias VI sans supplémentation d'autres glucides. Ce chiffre est modifié à partir de Yin et al. 11 Ans, états-unis ( Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Effets de la disponibilité de l'EPS sur la production de SCFA après 24 h et 48 h de fermentation.
Des acides acétiques, propionic, isobutyric, butyriques, isovaleric, et des acides valeric ont été détectés utilisant la chromatographie de gaz. VI-Bif, VI-Starch et VI indiquent les échantillons qui ont été prélevés après la culture à l'aide de vi médias, EPS, VI médias et amidon, et VI médias, respectivement. Tous les échantillons ont été mesurés en triplicate. Les chiffres ont été générés à l'aide de GraphPad Prism Version 5.01. Les panneaux représentent les concentrations d'acide organique dans chaque échantillon fermenté pour A, acide acétique; B, acide propionique; C, acide isobutyrique; D, acide butyrique; E, acide isovalérique; et F, l'acide valeric. Ce chiffre est modifié à partir de Yin et al.11Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Des progrès significatifs ont été réalisés vers la compréhension de la composition et des activités du microbiote intestinal humain au cours de la dernière décennie. À la suite de ces études, le concept holobiont a émergé, qui représente les interactions entre les hôtes et les communautés microbiennes associées, comme entre les humains et leur microbiote intestinal19,20. En outre, les humains sont même maintenant considérés comme des super-organismes21, dans lequel le microbiote intestinal ont été reconnus comme l'un des organes fonctionnels chez l'homme22,23. Le corps humain abrite un écosystème microbien complexe, composé d'environ 1013 cellules microbiennes24. En outre, les génomes du microbiote intestinal sont considérés comme des génomes auxiliaires de l'homme qui codent de nombreux gènes métaboliques qui élargissent les capacités métaboliques de l'hôte4. Cependant, les xénobiotiques, y compris les médicaments thérapeutiques et les composés bioactifs diètes, peuvent potentiellement modifier la structure de la communauté du microbiome intestinal et les fonctions associées5. De plus en plus d'études ont indiqué que les interactions entre le microbiote intestinal et les xénobiotiques jouent un rôle important dans la médiation de la toxicité chimique et la cause, ou exacerbe, les maladies humaines6,7. Ainsi, les études des interactions entre les xénobiotiques et le microbiote intestinal humain ont récemment attiré l'attention de la recherche.
Les modèles de souris ont été les méthodes les plus largement utilisées pour étudier les interactions entre le microbiote et les hôtes. Cependant, les différences dans la composition et les activités entre le microbiote intestinal des humains et les souris25 peuvent entraîner une modélisation inadéquate des interactions humaines par des études de souris. Néanmoins, les considérations de bioéthique exigent l'utilisation minimale des souris. Une alternative aux modèles in vivo ci-dessus est la fermentation par lots, qui peut être utilisée pour simuler le microbiote intestinal humain in vitro26. Par conséquent, des expériences de fermentation ont été utilisées pour étudier les interactions entre les xénobiotiques et le microbiote intestinal humain. Par exemple, Yin et coll. 17 ont utilisé des expériences de fermentation par lots pour étudier les interactions entre les polysaccharides et le microbiote intestinal humain. Les résultats de cette étude indiquent que certains polysaccharides peuvent être métabolisés par le microbiote intestinal humain, et que les polysaccharides modulent la communauté bactérienne humaine et les métabolites qu'ils produisent in vitro, y compris les SCFA. Cependant, certaines considérations méthodologiques sont essentielles pour l'utilisation de ce protocole. Par exemple, des échantillons fécaux doivent être prélevés dès que possible, et une chambre anaérobie devrait être utilisée pour assurer la croissance des anaerobes obligatoires. Cette dernière considération est particulièrement critique, parce que l'exposition à l'oxygène peut conduire à la mort de certaines populations bactériennes intestinales et donc, l'altération de la communauté bactérienne. En outre, les xénobiotiques sont métabolisés dans le système digestif supérieur. Par conséquent, la modélisation des interactions entre les xénobiotiques et le microbiote du système digestif inférieur est une considération importante pour la modélisation in vivo.
Les expériences de fermentation par lots ont des avantages évidents par rapport aux études in vivo sur l'homme et l'animal parce qu'elles sont plus économiquement réalisables et pratiques. En outre, ils peuvent être utilisés pour étudier la variation interindividuelle des réponses du microbiote intestinal humain à l'exposition xénobiotique. En outre, la fermentation par lots peut être facilement appliquée pour manipuler les communautés de microbiotes et évaluer leurs fonctions métaboliques associées. Cependant, les systèmes de fermentation par lots souffrent de la limitation de la dynamique statique de l'état. De futures études pourraient mettre en œuvre des chemostats bioréacteurs qui permettent la modulation dynamique du pH, de la température et du péristaltisme, tout en maintenant un approvisionnement régulier en nutriments et l'élimination continue des déchets. De telles activités permettraient d'imiter les voies intestinales in vivo et de fournir de nouvelles informations pour compléter celles des expériences de fermentation par lots. Une limitation supplémentaire des expériences de fermentation par lots est qu'elles éliminent toutes les interactions entre les microbiome et les tissus hôtes. Cela pourrait être une considération particulièrement importante, car certains xénobiotiques (p. ex. méthamphétamine) peuvent être co-métabolisés par les cellules humaines et le microbiote intestinal27. En outre, des études récentes ont indiqué que le métagénome intestinal (GM) peut indirectement réguler le métabolisme xénobiotique par le biais de la régulation de l'expression des gènes de l'hôte8.
Bien que des développements des systèmes de fermentation par lots soient encore nécessaires, ces systèmes peuvent être largement utilisés pour le haut débit et le criblage rapide des interactions entre les xénobiotiques et le microbiote intestinal humain. L'élucidation des mécanismes sous-jacents à la résistance et au métabolisme xénobiotiques dans les microbiomes actifs de l'intestin humain fournira des informations importantes sur la variation inexpliquée de l'efficacité et de la toxicité des médicaments8,9. En outre, une compréhension plus détaillée de la façon dont les régimes alimentaires et les composants alimentaires spécifiques modifient le métabolisme microbien et, par conséquent, l'effet de la santé de l'hôte est la première étape vers la réalisation de l'objectif de la médecine personnalisée par la modulation du microbiote.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas de conflits d'intérêts. Les chiffres ont été cités dans Yin et al. 11.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par la National Nature Science Foundation of China (no 31741109), la Hunan Natural Science Foundation (no 2018JJJ300) et le programme de construction de la discipline caractéristique appliquée à l'Université des sciences et de l'ingénierie du Hunan. Nous remercions LetPub (www.letpub.com) pour son aide linguistique lors de la préparation de ce manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
References
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