Summary
ここで説明する内生生物とヒト腸内微生物叢との相互作用をインビトロバッチ発酵システムを用いて調べるプロトコルである。
Abstract
近年、ヒトの腸内微生物は、人間の健康を促進し、病気を予防する研究の重要なターゲットとなっています。その結果、内生生物(例えば、薬物およびプレバイオティクス)と腸内微生物叢との相互作用の研究は重要な研究テーマとなっている。しかし、人間のボランティアとの生体内実験では、生命倫理と経済的制約のために、このような研究には理想的ではありません。その結果、動物モデルは、生体内でのこれらの相互作用を評価するために使用されている。それにもかかわらず、動物モデル研究は、動物とヒトの微生物叢の組成や多様性に加えて、生物倫理の考慮事項によって依然として制限されています。別の研究戦略は、インビトロで内生生物と腸内微生物叢の相互作用の評価を可能にするバッチ発酵実験の使用です。この戦略を評価するために、ビフィズス菌(Bif)外糖(EPS)を代表的な異生物性として使用した。次に、Bif EPSとヒト腸内微生物叢との相互作用を、薄層クロマトグラフィー(TLC)、16S rRNA遺伝子ハイスループットシーケンシングによる細菌コミュニティ組成解析、ガスクロマトグラフィーなどのいくつかの方法を用いて検討した。短鎖脂肪酸(SCFA)の。ここでは、インビトロバッチ発酵システムを用いて内生生物とヒト腸内微生物叢との相互作用を調査するプロトコルを提示する。重要なことに、このプロトコルは、他の内生生物と腸内微生物叢間の一般的な相互作用を調査するために変更することもできます。
Introduction
腸内細菌叢は、人間の腸の機能と宿主の健康に重要な役割を果たしています。その結果、腸内微生物叢は最近、疾患予防と治療の重要な標的となっている1.さらに、腸内細菌は宿主腸細胞と相互作用し、代謝活動、栄養利用性、免疫系変調、さらには脳機能と意思決定を含む基本的な宿主プロセスを調節する2、3.内生生物は、腸内微生物叢の細菌組成と多様性に影響を与えるかなりの可能性を持っています。したがって、内生生物とヒト腸内微生物叢との相互作用は、研究の注目を集めている 4,5,6,7, 8,9.
生体倫理と経済的制約のために生体内の内生生物とヒト腸内微生物叢との相互作用を評価することは困難である。例えば、内生生物とヒト腸内微生物叢の相互作用を調べた実験は、食品医薬品局の許可なしには行うことができず、ボランティアの募集は高価です。その結果、動物モデルは、多くの場合、このような調査のために使用されます。しかし、動物モデルの使用は、異なる微生物叢組成物と動物対ヒト関連のコミュニティにおける多様性のために制限される。内生生物とヒト腸内微生物叢との相互作用を探索するインビトロ法は、バッチ培養実験を用いて行う。
外食糖(EPS)は、ヒトの健康の維持に著しく寄与するプレバイオティクスである10.異なる単糖組成物と構造からなる異なるEPSは、異なる機能を示すことができます。これまでの分析では、現在の研究11で標的とされる代表的な異種生物学であるBif EPSの組成を決定した。しかし、宿主関連代謝効果はEPS組成および多様性に関して考慮されていない。
ここで説明するプロトコルは、12人のボランティアからBif EPSを発酵させるfecal微生物叢を使用する。薄層クロマトグラフィー(TLC)、16S rRNA遺伝子ハイスループットシーケンシング、およびガスクロマトグラフィー(GC)を組み合わせて、EPSとヒト腸内微生物叢との相互作用を調べます。生体内実験と比較して、このプロトコルの明確な利点は、ホストの代謝からの干渉効果の低コストおよび回避である。さらに、記載されたプロトコルは、内生生物とヒト腸内微生物叢との相互作用を調査する他の研究で使用することができる。
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Protocol
このプロトコルは、湖南理工学大学(中国湖南省)と浙江省権江大学(浙江省)の倫理委員会のガイドラインに従っています。
1. 細菌の調製
- ビフィズス菌培地ブロスの調製
- 蒸留水の950 mLで以下の成分を組み合わせる:肉エキス、5グラム/L。酵母エキス, 5グラム/L;カゼインペプトン, 10 g/L;大豆色, 5グラム/L;ブドウ糖, 10 グラム/L;K2HPO4,2.04 g/L;MgSO4·7H2O, 0.22 グラム/L;MnSO4.H20, 0.05 g/L;ナクル、5グラム/L;トウェン 80, 1 mL;塩溶液, 40 mL (CaCl2.2H2O, 0.25 g/L;KH2PO4,1 g/L;NaHCO3, 10 g/L;NaCl,2グラム/L);レサズリン, 0.4 mL (2.5 mg/L).pHを2 M NaOHで6.8に調整します。
- 121 °Cで15分間オートクレーブを行い、嫌気性条件下でスープを室温(RT)まで冷却することができます(10%H2、10%CO2、80%N2)。フィルター殺菌システイン-HCl(0.5g/L)とムピロシン(5mg/L)を培地に添加します。
- 凍結ビフィズス菌ロングムのアリコート(50μL)を嫌気条件下で5mLのビフィズス菌培地ブロスを培養チューブに加え、次いで37°Cで24時間の嫌気性インキュベーターで培養する。
2. ビフィズス菌エプスの調製
- PYG寒天培地の調製
- 以下を組み合わせる: ペプトン, 20 グラム/L;酵母エキス, 10 g/L;ブドウ糖, 5 g/L;NaCl, 0.08 g/L;CaCl2, 0.008 g/L;MgSO4·7H2O, 0.008 グラム/L;K2HPO4, 0.04 g/L;KH2PO4,0.04 g/L;NaHCO3, 0.4 g/L;10 M NaOH を使用して pH を 7.2 に調整します。
- 121 °Cで15分間メディアをオートクレーブし、~50°Cまで冷却します。次いで、培地1L当たり、フィルター殺菌ビタミンK1溶液の0.5mL(99%エタノールの99mLに溶解したビタミンK1の1g)、5mLのヘミン溶液(1モル/L NaOHの1mLに溶解したヘミンの0.5g)を添加する。 その後、蒸留水で100mLまで持ち込み、システイン-HClを0.5gにした。
- PYGプレートを注ぐ前に、フィルター殺菌5-ブロモ-4-クロロ-3-アドリルβ-D-ガラクトピラノシド(X-Gal、0.06 g/L)、LiCl·3H2O(5.7 g/L)およびムピロシン(5mg/L)を培地に加えます。
注:X-GalおよびLiCl.3H2Oは着色変化によって版のB.ロングラムコロニーの同定を可能にする。
- 20 μLのB.ロングラム株(ステップ1.2)をPYGプレートに接種し、嫌気性インキュベーターを37°Cで72時間置きます。
- 計量スクープを使用してPYGプレートから粘膜細菌コロニーを収集し、その後、渦発振器を使用してリン酸緩衝生理食生(PBS)の10 mLで完全に再中断します。
注:細菌およびEPS混合物は、繊維がPBSに完全に溶解するまで、渦巻きまたはピペッティングを繰り返し繰り返すことによって完全に再懸濁する必要があります。 - サスペンションを6,000 x gで5分間遠心分離します。
- 慎重に新しい遠心管に上清を転送し、繰り返し反転とブレンドすることにより、冷たい99%エタノールの3つのボリュームと完全に混合します。
- 5分間6,000 x gで混合物を遠心分離し、上清を完全に除去する。
- 速度真空を使用してEPS抽出物を一晩削り乾燥させ、遠心管から沈殿物を取り除きます。
3. 発酵培地の調製
- 基礎培養培地VIの調製
- 以下を組み合わせる:ペプトン、3グラム/L。トリプトン, 3 g/L;酵母エキス, 4.5 g/L;ムチン, 0.5 グラム/L;胆汁酸塩 第3号, 0.4 g/L;ナクル、4.5グラム/L;KCl、2.5グラム/L;MgCl2·6H2O, 4.5 グラム/L;1 mL トウェン 80;CaCl2.6H2O, 0.2 g/L;KH2PO4, 0.4 g/L;MgSO4·7H2O, 3.0 グラム/L;MnCl2·4H2O, 0.32 グラム/L;フェソ4·7H2O, 0.1 グラム/L;CoSO4·7H2O, 0.18 グラム/L;CaCl2·2H2O, 0.1 グラム/L;ZnSO4·7H2O, 0.18 グラム/L;CuSO4·5H2O, 0.01 g/L;NiCl2·6H2O, 0.092 g/L. pHを1 M HClで6.5に調整します。
- セクション2.1で行われたようにヘミンとシステインを準備し、オートクレーブと冷却後に追加します。
- VIベースメディアを使用して、異なる炭素源を含む培養メディアを準備します。オートクレーブする前に、Bif EPS繊維の8g/Lを培地VIに加え、グループVI_Bifを含む。さらに、グループVI_Starchを表すために中VIに8g/Lデンプンを追加します。最後に、炭素源を添加せずに培地VIを対照(群VI)として用いられる。
注:Bif EPSおよびデンプンは、まず磁気攪拌機を使用してお湯に溶解し、次いで調製VI培地と混合する。 - 121 °Cで15分間すべてのメディアをオートクレーブし、RTに冷却することができます。
- 各培地のサブサンプル(5mL)を嫌気性インキュベーターで培養管に移し、残りの培地を4°Cに保存する。
4. ヒトの大便サンプル調製
- 健康な成人の人間のボランティアから新鮮な排便の直後に、便器容器を使用して新鮮な排便を採取し、その後、スラリー製剤に使用します。
注:サンプル収集の前に、すべてのボランティアは、サンプルを寄付する前に少なくとも3ヶ月間、抗生物質、プロバイオティクス、またはプレバイオティクス治療を受けないようにスクリーニングする必要があります。さらに、すべての寄付者は、情報に基づいた書面による同意を提供する必要があります。 - 新鮮な大さじサンプル(1g)を0.1M嫌気性PBS(pH 7.0)の10mLにガラスビーカーに移し、ガラス棒を使用して10%(w/v)スラリーを調製します。
- 0.4 mMふるいを使用して、fecal スラリーをろ過します。次いで、濾過されたスラリーのサブサンプルを使用してバッチ培養発酵実験を接種し、残りを-80°Cで保存してさらなる分析を行う。
注:ステップ4.2-4.3は嫌気性室で行われます。
5. インビトロバッチ発酵
- 濾過された大腿骨スラリー(500μL)を嫌気室内のステップ3.2で調製した発酵培地に加え、37°Cでインキュベートする。
- 嫌気性チャンバーで24時間と48時間で発酵サンプルの2 mLを収集し、3分間6,000 x gでチャンバーの外に遠心分離機を集めます。
- 上清を、多糖類分解分析および短鎖脂肪酸(SCFA)測定に使用する新しい遠心チューブに慎重に移します。
- 遠心分離ペレットを-80°Cで保存し、その後細菌ゲノムDNA抽出に使用します。
6. ヒトの大腿骨微生物叢によるEPS分解
- 発酵した上清を0.2μLの発酵槽をあらかじめコーティングしたシリカゲル-60 TLCアルミニウム板に積み込み、毛ドライヤーを使用して乾燥させます。
- ギ酸/n-ブタノール/水(6:4:1、v:v:v)溶液の20 mLでプレートを開発し、毛ドライヤーを使用して乾燥させます。
- 染色するためにオルシノール試薬にプレートを浸し、その後、ヘアドライヤーを使用して乾燥させます。
- 蒸留水の25 mLに900mgのリシェノールを溶解し、375mLのエタノールを添加してオルシノール試薬を調剤する。その後、濃縮硫酸をゆっくりと添加し、溶液を十分に混合する必要があります。
- ベーキングオーブンで3分間120°Cでプレートを加熱し、TLCバンドを測定してEPSの劣化を評価します。
7. ヒト腸内微生物叢に及ぼすEPSの影響
- ステップ4.3で調製した元の大腿骨サンプルと、ステップ5.4で調製した発酵サンプルを凍結解凍します。
- 製造元の指示に従って便細菌ゲノムDNA抽出キットを使用して、すべてのサンプルから細菌ゲノムDNA(gDNA)を抽出します。
- マイクロ分光光度計と寒天ゲル電気泳動を使用して、DNA濃度、整数、およびサイズ分布を決定します。
- 前述の前方および逆プライマー12を用いて抽出されたgDNAから細菌16S rRNA遺伝子のPCRを行う:
-フォワードプライマー(バーコードプライマー338F):アクトッカグガグガッカ
-リバースプライマー(806R): GGACTACHVGGGTWTTTAAT
次のサーマル サイクラー条件を使用します。- 94 °C 5分
- 30sのための94 °C。
- 30sのための55 °C。
- 72 °C 1分
- 35 サイクルで 2 ~ 4 を繰り返す
- 72 °C 5分
- 4 °Cは、サーマルサイクラーから取り外すまで保持します。
- 超高スループット微生物コミュニティ解析を用いたDNAシーケンシング企業で、PCR製品のハイスループットシーケンシングを行います。
- 微生物生態学(QIIME)配列分析パイプライン13に対する定量的洞察を使用して、クリーンで高品質なシーケンスを取得します。
- Mothurソフトウェアスイート14などのバイオインフォマティクスツールを使用して、97%を超えるヌクレオチド類似性を持つ16S rRNA遺伝子配列に対する操作用分類単位(OTUs)を定義する。
- 各 OTU から代表的なシーケンスを選択し、RDP 分類器と SILVA 分類データベースを使用して、代表的なシーケンス15を分類します。
- バイオインフォマティクスツール16を使用して、グッドのカバレッジ、アルファダイバーシティメトリック(シンプソンとシャノン指数を含む)、および豊かさ(観測されたOTUsの数)を計算します。
8. ヒト腸内微生物叢によるSCFA産生に及ぼすEPSの影響
- ステップ5.3~2mL遠心管で調製した発酵上清(1mL)を加えます。
- 各サンプルに25%(w/v)のメタリン酸の0.2 mLを加え、ボルテキシングで溶液を十分に混合します。
- 13,000 x gで20分間混合物を遠心分離し、上清を新鮮なチューブに移します。
- 併用して、120 mM酢酸、プロピオン酸、ブチリック、アイソブチリック、バレリックおよびイソバレル酸の溶液を調調します。次に、各調製酸の1mLを25%(w/v)の1.2mLに加え、標準カクテルとして使用する。
- 0.22 μM膜を使用してサンプルを濾過します。
- 前述のプロトコル11、17に従って高性能ガスクロマトグラフィーを使用してSCFA濃度を検出する。
注: InertCap FFAP カラム(0.25 mM x 30 m x 0.25 μM)は、ガスクロマトグラフィー(GC)に使用されます。SCFA濃度は、GCソリューションソフトウェアパッケージのシングルポイント内部標準法を使用してピーク領域に基づいて定量されます。
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Representative Results
粘膜EPSの産生は、72時間の嫌気性インキュベーション後のPYGプレート上のB.ロング培養において観察された(図1A)。培養スクローの遠心分離は、続いてエタノール沈殿および乾燥、セルロース様EPSの採取をもたらした(図1B)。乾燥EPSおよび可溶性デンプンは、次いで発酵培養のための炭素源として使用された。TLCは、その低コストおよび迅速な結果ターンアラウンド18によるオリゴ糖分離および純度分析に使用された。ヒトの大腿骨微生物叢によるデンプンの分解率はBif EPS(図2)よりも速かったが、一部のEPS接種サンプルではBif EPSの分解が明らかに認められた。
その後、16S rRNA遺伝子ハイスループットシーケンシングと主座標解析(PCoA)を用いたコミュニティ組成解析を行い、Bif EPSがヒト腸内微生物叢に及ぼす影響を調べた。VI_BifおよびVI_Starch群からのサンプルは、PCoA分析(図3A)において互いに別々にクラスター化され、EPSおよびデンプンの利用可能性がヒトの大腿菌細菌群を区別的に形成することを示す。線形判別効果サイズ(LEfSe)は、VI_BifとVI_Starch治療の間で異なる特定の細菌タキサを区別するためにさらに使用されました。ジェネラ・コリンセラ、コプロコッカス、パラバクテロイド、ロドプセウドモナスは、VI_BchサンプルよりもVI_Bifサンプルにおいて有意に多かった(図3B)。さらに、異なる炭素源の添加後に生産を評価するために、いくつかのSCFAに対してGC測定を行いました。発酵培養物から測定したSCFAには、酢酸、プロピオン、アイソブチリック、ブチリック、イソバレリック、バレリック酸が含まれていた。24時間および48時間の発酵後、前述の6つのSCFA濃度のうち5個は治療間で類似しており、VI_Bif、VI_Starch、およびVI群間で統計的に異なっていなかった。しかし、プロピオン酸濃度はVI_Bif群に比べて有意に高かった(図4)。
図1:B.ロングムによって生成されたEPS。
凍結B.ロングムはビフィズス菌培地ブロスで復元し、次いでPYGプレートにストリークし、続いて72h(A)の37°Cで嫌気性インキュベーションを行った。細菌培養により産生されるEPSをプレート培養物から削り取り、エタノールを用いて沈殿させ、速度真空(B)を用いて一晩乾燥させた。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ヒト腸内微生物叢によるインビトロEPSおよびデンプン分解のTLC分析
TLC分析は、嫌気性条件下で成長した各発酵培養から24時間及び48時間で採取した0.2μLサンプルに対して行った。VI、VI_Starch、およびVI_Bifは、それぞれVI培体、VI培中+デンプンサプリメント、およびVI培体+EPSサプリメントを示す。図1~12は、発酵実験の接種に使用された12人のボランティアからの胎児細菌サンプルを示す。対照群は、追加のカーボンサプリメントを含まない治療を表す。この図は Yin らから変更されています。11.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ヒト腸内微生物叢群に対するBif EPSの利用可能性の影響
(A) 重み付けされていないUniFracメトリックに基づく腸内微生物叢コミュニティ組成の不一致のPCoAプロット。(B) 治療群間で差異的に豊富であった細菌タキサのLEfSE分析。p< 0.05のカットオフを用い、グループ間の細菌分類差の統計的有意性を評価した。オリは、ボランティアの胎児サンプルの腸内微生物叢を示す。VI_BifおよびVI_Starchは、それぞれ炭素基板としてEPSとデンプンを用いたVI培体を用いた発酵試料からの腸内微生物叢を示す。VIは、他の炭水化物を補充することなくVI培温における腸内微生物叢接種発酵を伴う対照群を表す。この図は Yin らから変更されています。11歳この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:発酵の24時間および48時間後のSCFA産生に対するEPSの利用可能性の影響
酢酸、プロピオン、アイソブチリック、ブチリック、アイソバレリック、およびバレリン酸は、ガスクロマトグラフィーを用いて検出された。VI_Bif、VI_Starch、およびVIは、それぞれVI培養+EPS、VI培メディア+デンプン、およびVI培養物を用いて培養後に採取したサンプルを示す。全てのサンプルを三分の三単位で測定した。図は、グラフパッドプリズムバージョン5.01を使用して生成されました。パネルは、A、酢酸の各発酵試料内の有機酸濃度を表します。B, プロピオン酸;C, イソブチル酸;D, ブチル酸;E, イソバレリン酸;そしてF、バレリック酸。この図は Yin et al.11から変更されています。
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Discussion
過去10年間にわたり、ヒト腸内微生物叢の組成と活動の理解に向けて大きな進歩が見られました。これらの研究の結果として、ホロビオエント概念が出現し、ヒトと腸内微生物叢19、20との間のような宿主および関連する微生物群相との相互作用を表す。さらに、ヒトは現在でも超生物21とみなされ、腸内微生物叢はヒト22、23における機能器官の一つとして認識されている。人体は、約10個の13個の微生物細胞24からなる複雑な微生物生態系をホストしている。さらに、腸内微生物叢のゲノムは、宿主の代謝能力を拡張する多数の代謝関連遺伝子をコードするヒトからの補助ゲノムと考えられている4。しかしながら、治療薬および食事由来の生理活性化合物を含むゼノバイオティクスは、腸内微生物叢コミュニティ構造および関連機能5を潜在的に変化させる可能性がある。研究の増加は、腸内微生物叢と異種生物製剤との相互作用が化学毒性を媒次化し、原因となる、またはそうでなければ悪化させる、ヒト疾患6、7に重要な役割を果たしていることを示している。このように、異種生物生物とヒト腸内微生物叢との相互作用の研究は、最近、重要な研究の注目を集めています。
マウスモデルは、微生物叢と宿主との相互作用を調べるために最も広く使用されている方法である。しかしながら、ヒトとマウス25の腸内微生物叢間の組成および活性の違いは、マウスの研究を通じてヒト相互作用の不十分なモデリングをもたらす可能性がある。それにもかかわらず、生命倫理の考慮事項は、マウスの最小限の使用を必要とします。生体内モデルにおける上記の代替手段は、インビトロ26におけるヒト腸内微生物叢のシミュレーションに使用できるバッチ発酵である。その結果、発酵実験は、異生物生物とヒト腸内微生物叢との相互作用を調えるために使用されてきた。たとえば、Yin etal.17は、多糖類とヒト腸内微生物叢との相互作用を調べるためにバッチ発酵実験を使用している。この研究の結果は、一部の多糖類がヒト腸内微生物叢によって代謝され、多糖類がSCFAを含むインビトロで産生するヒト細菌群集および代謝産物を調節することを示している。ただし、このプロトコルを使用するには、いくつかの方法論的な考慮事項が重要です。例えば、フェカルサンプルはできるだけ早く収集し、嫌気性室は、義務的な嫌気性の成長を確保するために使用されるべきです。酸素暴露は、いくつかの腸内細菌集団の死につながり、したがって、細菌群の変化につながる可能性があるため、後者の考慮は特に重要です。さらに、異生物異性菌は上部消化器系で代謝される。したがって、異生物分析と下部消化器系微生物叢との相互作用のモデリングは、生体内モデリングにおいて重要な考慮事項である。
バッチ発酵実験は、より経済的に実現可能で便利であるため、生体内のヒトおよび動物研究に対して明らかな利点があります。さらに、それらは、異種生物生暴露に対するヒト腸内微生物叢応答の個々の変動を調査するために使用することができる。さらに、バッチ発酵は、微生物叢群を操作し、関連する代謝機能を評価するために容易に適用することができる。しかし、バッチ発酵システムは、静的状態ダイナミクスの限界に苦しんでいます。今後の調査では、栄養素の安定供給と廃棄物の継続的な除去を維持しながら、pH、温度、蠕動の動的変調を可能にするバイオリアクターケモスタットを実装することができます。このような活動は、実験がより良い生体内腸管を模倣し、バッチ発酵実験からそれらを補完するための新しい洞察を提供することを可能にします。バッチ発酵実験のさらなる制限は、それらがすべてのマイクロバイオーム宿主組織相互作用を除去することである。いくつかのゼノバイオティクス(例えば、メタンフェタミン)はヒト細胞と腸内微生物叢27によって共代謝され得るように、これは特に重要な考慮事項であり得る。さらに、最近の研究は、腸メタゲノム(GM)が宿主遺伝子発現調節8を調節することにより、異種生物代謝を間接的に調節できることを示している。
バッチ発酵システムの開発はまだ必要であるが、これらのシステムは、広く高スループットと異種生物学とヒト腸内微生物叢間の相互作用の迅速なスクリーニングのために使用することができます。活性ヒト腸内微生物叢における異生物性耐性および代謝の根底にあるメカニズムを解明することは、薬物有効性および毒性の原因不明の患者間変動に関する重要な洞察を提供する8,9である。さらに、食事や特定の食品成分が微生物代謝をどのように変化させ、結果的に宿主の健康に影響を与えるかをより詳細に理解することは、微生物変調による個別化医療の目標の実現に向けた第一歩です。
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Disclosures
著者らは、利益相反がないと宣言している。数字はYinらで引用された。11.
Acknowledgments
本研究は、中国国家自然科学財団(No.31741109)、湖南自然科学財団(No.2018JJ3200)、湖南理工学大学応用特性規律の構築プログラムによって資金提供されました。私たちは、この原稿の準備中にその言語的援助のためにLetPub(www.letpub.com)に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
References
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