حقن Gryllus بيماكولاتوس البيض
Summary
هنا نقدم بروتوكول لحقن بيض الكريكيت، وهي تقنية التي تعمل كطريقة تأسيسية في العديد من التجارب في الكريكيت، بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر، تدخل الحمض النووي الريبي والتلاعب الجينومي.
Abstract
تغيير وظيفة الجينات في كائن حي النامية أمر أساسي لأنواع مختلفة من التجارب. في حين تم تطوير أدوات وراثية قوية للغاية في أنظمة النماذج التقليدية، فإنه من الصعب التعامل مع الجينات أو رسول RNA (mRNA) في معظم الكائنات الحية الأخرى. وفي الوقت نفسه، تعتمد النُهج التطورية والمقارنة على استكشاف وظيفة الجينات في العديد من الأنواع المختلفة، مما يستلزم تطوير وتكييف تقنيات التلاعب بالتعبير خارج نطاق الحشرات حالياً. الانواع. يصف هذا البروتوكول طريقة لحقن الكواشف في بيض الكريكيت لاختبار آثار التلاعب معين على التنمية الجنينية أو اليرقات. يتم وصف تعليمات حول كيفية جمع وحقن البيض مع الإبر البكرة. هذه التقنية واضحة نسبيا مرنة ويمكن أن تتكيف مع الحشرات الأخرى. يمكن للمرء جمع وحقن العشرات من البيض في تجربة واحدة، ومعدلات البقاء على قيد الحياة لحقن العازلة فقط تحسين مع الممارسة ويمكن أن تكون عالية كما 80٪. هذه التقنية سوف تدعم عدة أنواع من النهج التجريبية بما في ذلك حقن العوامل الدوائية، في المختبر توج mRNA للتعبير عن الجينات ذات الاهتمام، RNA المزدوج الذين تقطعت بهم السبل (dsRNA) لتحقيق تدخل الحمض النووي الريبي، واستخدام مجمعة بانتظام يُكرّر البَرَدّم القصير المُتداخل (CRISPR) بالتنسيق مع الكواشف المرتبطة بالبروتين 9 (Cas9) المرتبطة بـ CRISPR لتعديل الجينوم، والعناصر القابلة للتبديل لتوليد خطوط جينية عابرة أو مستقرة.
Introduction
القدرة على تعديل الجينوم أو التأثير على التعبير الجيني في الكائنات الحية هو الأساس لتصميم أنواع كثيرة من التجارب اختبار السببية الوظيفية. ومن الأهمية بمكان أيضاً بالنسبة للعمل المقارن والتطوري ذي الصلة أن تكون تقنيات التعديل الجينومي وغير الجينومي متاحة في الكائنات الحية خارج النظم التقليدية النموذجية للمختبرات الوراثية الحيوانية (مثل موسوكولوس، ودانيو rerio, Drosophila melanogaster, وCaenorhabditis elegans). سواء كانت الرغبة في فهم التنوع الحي1 أو التزام المرء بمبدأ كروغ، أنه لكل سؤال بيولوجي هناك كائن أكثر ملاءمة لحلها 2،3،والقدرة على تعديل الجينوم أو التأثير على التعبير الجيني ضروري للتصاميم التجريبية الحديثة.
الكريكيت Gryllus bimaculatus هو نظام نموذج الناشئة. تستخدم في القرن الماضي في تجارب علم الأعصاب4، شهد العقدان الماضيان اهتماما تجريبيا متزايدا في الكريكيت ، وخاصة ركزت على تطور وتطور هذا الكائنالحي 5. الكريكيت هو حشرة هيمتابولوس التي تتفرع بشكل خاص إلى الحشرات الهولوميتابولوس مدروسة جيدا، مثل D. melanogaster وTribolium castaneum6. نظرا لموقعها المفيد على شجرة التطور ، والعلماء مهتمون في طرح الأسئلة التجريبية الحديثة والمتطورة في هذه الحشرة ، مما أدى إلى اهتمام متزايد في تكييف الأدوات الجزيئية للاستخدام في G. bimaculatus.
ويمكن استخدام حقن الكواشف الجزيئية في بيض الكريكيت لتجارب التعديل الجينومي وكذلك التلاعب اتلاف التعبير الجيني في الأجنة. على سبيل المثال، تم إنشاء المعدلة وراثيا G. bimaculatus تحمل الإدراج eGFP باستخدام piggyBactransposase7،8. وقد نجح المحققون في إنشاء ضربة قاضية G. bimaculatus باستخدام nucleases الزنك الإصبع (ZFNs) والنسخ المنشط مثل (TAL) تأثير nucleases (TALENs) لإدخال فواصل مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل في مناطق جينية محددة9. على الرغم من أن ZFNs وTALENs تسمح باستهداف مواقع محددة في الحيوانات خارج الأنظمة النموذجية الأربعة الكبيرة، إلا أن هذه الكواشف قد تم تجاوزها بسرعة من خلال نظام CRISPR/Cas9، الذي هو أبسط للاستخدام، وأكثر كفاءة، ومرنة للغاية10. وقد استخدم كريسبر في G. bimaculatus لإنتاج خروج المغلوب11 وكذلك ضرب في خطوط12،13 بالإضافة إلى تعديل الجينوم ، يمكن حقن dsRNA في البيض لهدم التعبير mRNA في تطوير الأجنة، مما يسمح للمحققين لفهم دور نسخ محددة في جميع أنحاء التنمية14،15. وقد نشرت بعض التفاصيل المحدودة حول كيفية حقن بيض الكريكيت سابقا12.
هنا، ونحن نصف بروتوكول مفصل لحقن البيض في وقت مبكر G. bimaculatus. هذا البروتوكول فعال وقابل للتكيف بسهولة مع مختلف البيئات المختبرية، ومواد الحقن، وربما مع الحشرات الأخرى. في حين تم نشر تفاصيل إضافية لتصميم وتنفيذ التعديل الجيني والتجارب ضربة قاضية في مكان آخر12,13, هذه النهج سوف تعتمد في نهاية المطاف على بروتوكول الحقن مفصلة هنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
التحديات الرئيسية اثنين مع هذه التقنية هي القضايا ذات الصلة من حجم إبرة الأمثل والقدرة على البقاء. على الرغم من أن الإبر الصغيرة تحسن القدرة على البقاء على قيد الحياة، فإن الإبر ذات اللومن الأضيق لديها درجة أكبر من القوى الشعرية في العمل، مما يجعل من المرجح أن ينتقل صفار البيض إلى الإبرة م…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم البحوث الواردة في هذا المشروع من قبل جائزة التنمية المؤسسية (IDeA) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم المنحة P20GM10342 إلى HH3، ورقم جائزة NSF IOS-1257217 إلى الفريق.
Materials
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence | |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | ||
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- | |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) | |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | ||
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | ||
| Tubing to connect air source to microinjector | ||||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic | |
| Microwave | various | |||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26°C are needed. | ||
| cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | ||
| cricket wter | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | ||
| cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | ||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament | |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. | |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head | |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90mm diameter | |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand | |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure | |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 – 1.0 mm | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep | |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118mm | |
| syringe filters, 25mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 ml syringe | |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work | |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank | |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, | |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20uL Microloader | |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | ||
| 20X objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | ||
| camera | Leica | DMC 5400 | ||
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here | |
References
- Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).
- Krebs, H. A. The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
- Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. . Cricket neurobiology and behavior. , (1989).
- Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. . The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , (2017).
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).
- Shinmyo, Y., et al. piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus. Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).
- Watanabe, T., et al. Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases. Nature communications. 3, 1017 (2012).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
- Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets. Scientific Reports. 5, 15885 (2015).
- Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. Protocols in the Cricket. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).
- Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus. Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).
- Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus. Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).
- Miyawaki, K., et al. Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis. Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).
- Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect. Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).
- Larson, E., Andres, J., Harrison, R. Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets. PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).
- Donoughe, S., Extavour, C. G. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Biologie du développement. , (2016).
- Matsuoka, Y., et al. Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes. Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).
- Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects. Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).
- Bacon, J., Strausfeld, N. Nonrandom resolution of neuron arrangements. Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).
