Injetando ovos de Gryllus bimaculatus
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para injetar ovos do grilo, uma técnica que sirva como um método fundamental em muitas experiências no grilo, incluindo, mas não limitado a, a interferência do RNA e a manipulação genomic.
Abstract
Alterando a função gênica em um organismo em desenvolvimento é central para diferentes tipos de experimentos. Embora as ferramentas genéticas tremendamente poderosas tenham sido desenvolvidas em sistemas modelo tradicionais, é difícil manipular genes ou RNA mensageiro (mRNA) na maioria dos outros organismos. Ao mesmo tempo, abordagens evolutivas e comparativas dependem de uma exploração da função gênica em muitas espécies diferentes, necessitando do desenvolvimento e adaptação de técnicas para manipular a expressão fora do momento geneticamente tratável Espécie. Este protocolo descreve um método para injetar reagentes em ovos do grilo para ensaiar os efeitos de uma manipulação dada no desenvolvimento embrionário ou larval. Instruções sobre como coletar e injetar ovos com agulhas chanfradas são descritas. Esta técnica relativamente simples é flexível e potencialmente adaptável a outros insetos. Pode-se reunir e injetar dezenas de ovos em um único experimento, e as taxas de sobrevivência para injeções de buffer-only melhorar com a prática e pode ser tão alto quanto 80%. Esta técnica apoiará vários tipos de abordagens experimentais, incluindo a injecção de agentes farmacológicos, o mRNA tampado in vitro para expressar genes de interesse, RNA duplo-encalhado (dsRNA) para alcançar a interferência do RNA, o uso de aglomerados regularmente repetições palindrômicas curtas interespaçadas (CRISPR) em concerto com reagentes de proteína 9 (Cas9) associados à CRISPR para modificação genômica e elementos transponíveis para gerar linhas transgênicas transitórias ou estáveis.
Introduction
A capacidade de modificar o genoma ou influenciar a expressão gênica em organismos é a base para o projeto de muitos tipos de experimentos que testam a causalidade funcional. Também é fundamental para o trabalho comparativo e evolutivamente relevante que técnicas de modificação genômica e não-genômica estejam disponíveis em organismos fora dos sistemas de modelo animal de laboratório genético tradicional (por exemplo, Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans). Se é o desejo de compreender a diversidade organizosa1 ou a adesão ao princípio de Krogh, que para cada questão biológica há um organismo mais adequado à sua solução2,3, acapacidade de modificar genomas ou influência da expressão gênica é essencial para projetos experimentais modernos.
O grilo Gryllus bimaculatus é um sistema emergente de modelo. Usado para o século passado em experimentos de Neurologia4, as duas últimas décadas testemunharam um aumento do interesse experimental no críquete, particularmente focado na evolução e desenvolvimento deste organismo5. O grilo é um inseto hemimetábolos que ramifica basalmente aos insetos holometábolos well-estudados, tais como D. melanogaster e castaneum do Tribolium6. Devido à sua posição útil na árvore evolutiva, os cientistas estão interessados em fazer perguntas experimentais modernas e sofisticadas neste inseto, o que levou a um crescente interesse em adaptar ferramentas moleculares para o uso em G. bimaculatus.
Injeções de reagentes moleculares em ovos de críquete podem ser usadas para experimentos de modificação genômica, bem como manipulações não-genômica da expressão gênica em embriões. Por exemplo, G. bimaculatus transgênica carregando inserções de EGFP foram criadas usando a peptídeo piggybac7,8. Os investigadores criaram com sucesso o Knockout G. bimaculatus usando nucleases do zinco-dedo (ZFNs) e a transcrição ativador-como (tal) nucleases efetoras (Talens) para introduzir rupturas dobro-encalhados em regiões genomic específicas9. Embora ZFNs e TALENs permitam segmentação local específica em animais além dos quatro grandes sistemas de modelos, esses reagentes foram rapidamente ultrapassados pelo sistema CRISPR/Cas9, que é mais simples de usar, mais eficiente e altamente flexível10. Crispr tem sido usado em G. bimaculatus para produzir knock-out11 , bem como Knock-in linhas12,13 além de modificação genômica, dsRNA pode ser injetado em ovos para derrubar a expressão de mRNA no desenvolvimento embriões, permitindo que os investigadores compreendam o papel das transcrições específicas ao longo do desenvolvimento14,15. Alguns detalhes limitados sobre como injetar ovos de críquete foram publicados anteriormente12.
Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para injetar ovos adiantados do G. bimaculatus . Este protocolo é eficaz e facilmente adaptável a vários ajustes do laboratório, materiais da injeção, e possivelmente a outros insetos. Embora detalhes adicionais para projetar e implementar experimentos de modificação e knockdown genômica tenham sido publicados em outro lugar12,13, essasabordagens, emúltima análise, dependem do protocolo de injeção detalhado aqui.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os dois desafios principais com esta técnica são as edições relacionadas do tamanho e do survivability óptimos da agulha. Embora as agulhas menores melhorem o survivability, as agulhas com lúmens mais estreitos têm um maior grau de forças capilares no trabalho, que o faz mais provável que o gema se mova na agulha que causa o entupir. Na melhor das casos, os bloqueios podem ser limpos simplesmente injetando outro ovo ou limpando a agulha como descrito acima. Um pode igualmente tentar aumentar a pressão do contra…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A pesquisa relatada neste projeto foi apoiada por um prêmio de desenvolvimento institucional (IDeA) do Instituto Nacional de ciências médicas gerais dos institutos nacionais de saúde o número de subvenção P20GM10342 a HH3, e pelo número de prêmio NSF IOS-1257217 para CGE.
Materials
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence | |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | ||
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- | |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) | |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | ||
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | ||
| Tubing to connect air source to microinjector | ||||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic | |
| Microwave | various | |||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26°C are needed. | ||
| cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | ||
| cricket wter | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | ||
| cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | ||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament | |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. | |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head | |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90mm diameter | |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand | |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure | |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 – 1.0 mm | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep | |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118mm | |
| syringe filters, 25mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 ml syringe | |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work | |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank | |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, | |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20uL Microloader | |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | ||
| 20X objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | ||
| camera | Leica | DMC 5400 | ||
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here | |
References
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