Injection d'œufs Gryllus bimaculatus
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour injecter des œufs de cricket, une technique qui sert de méthode fondamentale dans de nombreuses expériences dans le cricket, y compris, mais sans s’y limiter, l’interférence de l’ARN et la manipulation génomique.
Abstract
La modification de la fonction génique dans un organisme en développement est au cœur de différents types d’expériences. Bien que des outils génétiques extrêmement puissants aient été développés dans les systèmes modèles traditionnels, il est difficile de manipuler des gènes ou de l’ARN messager (ARNM) dans la plupart des autres organismes. Dans le même temps, les approches évolutives et comparatives reposent sur une exploration de la fonction génique chez de nombreuses espèces différentes, nécessitant le développement et l’adaptation de techniques de manipulation de l’expression en dehors de la situation actuellement génétiquement traitable. espèce. Ce protocole décrit une méthode d’injection de réactifs dans les œufs de cricket pour évaluer les effets d’une manipulation donnée sur le développement embryonnaire ou larvaire. Des instructions sur la façon de recueillir et d’injecter des œufs avec des aiguilles bevées sont décrites. Cette technique relativement simple est flexible et potentiellement adaptable à d’autres insectes. On peut recueillir et injecter des dizaines d’œufs en une seule expérience, et les taux de survie pour les injections de tampon seulement s’améliorent avec la pratique et peuvent être aussi élevés que 80%. Cette technique soutiendra plusieurs types d’approches expérimentales, y compris l’injection d’agents pharmacologiques, l’ARNm plafonné in vitro pour exprimer des gènes d’intérêt, l’ARN à double brin (dsRNA) pour obtenir des interférences d’ARN, l’utilisation de grappes régulièrement répétitions palindromic courtes interspatiales (CRISPR) de concert avec des réactifs de protéines 9 (Cas9) associés au CRISPR (Cas9) pour la modification génomique, et des éléments transposables pour générer des lignes transgéniques transitoires ou stables.
Introduction
La capacité de modifier le génome ou d’influencer l’expression des gènes dans les organismes est à la base de la conception de nombreux types d’expériences testant la causalité fonctionnelle. Il est également essentiel pour les travaux comparatifs et évolutionnaires que les techniques de modification génomique et non génomique soient disponibles dans les organismes en dehors des systèmes traditionnels de modèle animal de laboratoire génétique (par exemple, Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogaster, et Caenorhabditis elegans). Qu’il s’agisse du désir de comprendre la diversité organistique1 ou de l’adhésion au principe de Krogh, que pour chaque question biologique il existe un organisme le mieux adapté à sa solution2,3, la capacité de modifier les génomes ou l’influence de l’expression de gène est essentielle pour des conceptions expérimentales modernes.
Le cricket Gryllus bimaculatus est un système modèle émergent. Utilisé pour le siècle dernier dans les expériences de neuroéthologie4, les deux dernières décennies ont été témoins d’un intérêt expérimental accru pour le cricket, en particulier axé sur l’évolution et le développement de cet organisme5. Le cricket est un insecte hémimétabolous qui se ramifie basally à des insectes holometabolous bien étudiés, tels que D. melanogaster et Tribolium castaneum6. En raison de sa position utile sur l’arbre évolutif, les scientifiques sont intéressés à poser des questions expérimentales modernes et sophistiquées dans cet insecte, ce qui a conduit à un intérêt croissant dans l’adaptation des outils moléculaires pour l’utilisation dans G. bimaculatus.
Les injections de réactifs moléculaires dans les œufs de cricket peuvent être utilisées pour des expériences de modification génomique ainsi que des manipulations non génomiques de l’expression génique chez les embryons. Par exemple, transgénique G. bimaculatus portant des insertions eGFP ont été créés à l’aide de la transposase piggyBac7,8. Les chercheurs ont réussi à créer des nucléases knock-out G. bimaculatus à l’aide de nucléases de zinc-doigt (ZNN) et d’activateurs de transcription (TAL) nucléases effecteurs (TALENs) pour introduire des pauses à double brin dans des régions génomiques spécifiques9. Bien que les ZFN et les TALEN permettent un ciblage spécifique au site chez les animaux au-delà des quatre grands systèmes modèles, ces réactifs ont rapidement été dépassés par le système CRISPR/Cas9, qui est plus simple à utiliser, plus efficace et très flexible10. CRISPR a été utilisé dans G. bimaculatus pour produire knock-out11 ainsi que knock-in lignes12,13 En plus de la modification génomique, dsRNA peut être injecté dans les œufs pour renverser l’expression de l’ARNm en développement embryons, permettant aux chercheurs de comprendre le rôle de transcriptions spécifiques tout au long du développement14,15. Quelques détails limités sur la façon d’injecter des œufs de cricket ont été publiés précédemment12.
Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour injecter les oeufs tôt de G. bimaculatus. Ce protocole est efficace et facilement adaptable à divers milieux de laboratoire, matériaux d’injection, et peut-être à d’autres insectes. Bien que des détails supplémentaires pour la conception et la mise en œuvre de modifications génomiques et d’expériences de renversement ont été publiés ailleurs12,13, ces approches finiront par s’appuyer sur le protocole d’injection détaillé ici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les deux principaux défis de cette technique sont les questions connexes de taille optimale des aiguilles et de la survie. Bien que les aiguilles plus petites améliorent la survie, les aiguilles avec des lumens plus étroits ont un plus grand degré de forces capillaires à l’œuvre, ce qui rend plus probable que le jaune se déplacera dans l’aiguille provoquant son obstruement. Dans le meilleur des cas, les blocages peuvent être éliminés simplement en injectant un autre œuf ou en dégageant l’aiguille comme décri…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les recherches rapportées dans le cadre de ce projet ont été soutenues par un prix de développement institutionnel (IDeA) de l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health sous le numéro de subvention P20GM10342 à HH3, et par le numéro de prix de la NSF IOS-1257217 Cge.
Materials
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence | |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | ||
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- | |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) | |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | ||
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | ||
| Tubing to connect air source to microinjector | ||||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic | |
| Microwave | various | |||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26°C are needed. | ||
| cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | ||
| cricket wter | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | ||
| cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | ||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament | |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. | |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head | |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90mm diameter | |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand | |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure | |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 – 1.0 mm | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep | |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118mm | |
| syringe filters, 25mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 ml syringe | |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work | |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank | |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, | |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20uL Microloader | |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | ||
| 20X objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | ||
| camera | Leica | DMC 5400 | ||
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here | |
References
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