Summary
体外细胞入侵测定使用含有蛋白质基质的细胞培养插入物,通过量化细胞入侵和迁移的可能性来测量癌症转移的潜能。细胞面临的挑战是通过蛋白质基质和多孔膜迁移,向化学吸引剂迁移,然后通过光显微镜进行量化。
Abstract
体外入侵测定使用博伊登室中富含蛋白质的基质来测量培养细胞通过基质和多孔膜的能力,其过程类似于癌细胞转移的初始步骤。被测试的细胞可以改变基因表达,或用抑制剂处理,以测试入侵潜力的变化。该实验测试小鼠乳腺肿瘤细胞的侵略性表型,以发现和表征促进细胞入侵的潜在肿瘤基因。然而,这种技术是通用的,可以适用于许多不同的应用。实验本身可以在一天内完成,结果在不到一天内通过光显微镜获得。结果包括用于比较和分析的入侵细胞数计数。体外入侵测定是一种快速、廉价和清晰的方法,用于确定培养物中的细胞行为,在更多地参与体内检测之前可用作初始评估。
Introduction
体外入侵测定在测量细胞通过蛋白质涂层膜迁移的能力时可能是一个有用的工具,类似于转移的第一步。恶性癌细胞的一个关键特征是它们能够通过附近的组织迁移和入侵。已经扩散或转移的癌症带来了更多的治疗挑战,并且长期存活率较低,而局部肿瘤更容易治疗,并且具有更高的长期存活率。为了转移,癌细胞必须离开原发性肿瘤,并迁移到循环或淋巴系统,这个过程需要通过细胞外基质和基底膜1。在称为上皮间质过渡(EMT)的过程中,肿瘤细胞必须打破细胞-细胞接触,定向迁移,并侵入附近的血液或淋巴血管。这个转移级联的初始步骤是极大的兴趣,因为这些步骤是什么可以使癌症更致命。转移早期步骤所涉及的遗传和表观遗传因素是大量研究的重点,但需要准确可靠的实验工具来测试这些早期步骤,包括体内和体外步骤。
测量细胞迁移变化的工具,如伤口愈合(划痕)测定或3D环境中的生长,如软琼脂测定,可以部分满足测量转移早期步骤的实验方法的需要,但测量入侵的测定是更具挑战性,因为这个过程发生在复杂的肿瘤微环境中的体内。为了筛选药物或基因改变,以确定入侵和转移中的重要因素,一个系统,可以在体外使用培养细胞和模拟转移细胞在体内面临的挑战是入侵测定2, 3.乳腺癌是女性最常诊断的癌症类型,也是女性癌症死亡的第二大原因,因此了解导致乳腺癌细胞入侵和转移的基因对公众健康至关重要。此外,小鼠细胞是研究乳腺癌及其进展的有用模型系统。
体外入侵测定基于博伊登室组件,其中两个生长培养层由多孔膜3分离。为了模仿肿瘤微环境,还包括一种富含蛋白质的凝胶,用于将一个腔室中的细胞与另一个腔室中的化学抑制剂分离,并作为基底膜屏障。为了向化学吸引剂迁移,细胞必须首先通过富含蛋白质的屏障,然后穿过多孔膜-这个过程类似于转移细胞如何通过频闪迁移的过程。富含蛋白质的凝胶可以根据实验的需要而改变,但通常由胶原蛋白或基底膜提取物(例如,Matrigel)4组成。它是蛋白质、蛋白酶和生长因子的复杂混合物,但主要由拉明宁和胶原蛋白IV 4,5组成。然后,细胞必须通过通常由聚碳酸酯、聚酯或聚四氟乙烯 (PTFE) 制成的多孔膜。膜可以商业购买,有或没有蛋白质凝胶(通常是胶原蛋白),或者凝胶可以单独购买和添加。孔径可以根据像元大小进行调整。虽然孔径为 0.4 - 8.0 μm,但只有 3.0 - 8.0 μm 的孔隙足够大,适合细胞迁移。入侵测定已用于确定抑制剂对细胞迁移和入侵能力的有效性。虽然缺乏体内存在的确切的肿瘤微环境,体外入侵检测有利于在短时间内筛选许多条件,同时最大限度地减少对动物模型的需求。这些实验的目的是比较疑似肿瘤的基因表达,并使用体外入侵测定和其他测试确定对癌细胞行为和疾病攻击性的影响。总体而言,入侵测定为确定转移电位提供了一致、定量和快速的结果,同时也是一种相对便宜、简单和适应性强的方法。
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Protocol
所有实验和方法均经维拉诺瓦大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)授权进行。
1. 培养小鼠乳腺肿瘤细胞的基因表达
- 首先,准备要测试的细胞系。
-
使用BALB/cV小鼠的繁殖群。这些小鼠携带BALB/cV菌株的小鼠乳腺肿瘤病毒,在牛奶6,7中传播给小狗。50%的繁殖雌性在10个月大时出现乳腺肿瘤。
- 要建立肿瘤细胞系,使用IACUC批准的协议牺牲一个肿瘤承载的大坝。将腹部皮肤浸泡在70%EtOH中,在无菌条件下在层流罩中切除肿瘤。肿瘤是皮下,所以小心避免刺穿围气。
- 将非坏死区的肿瘤碎片放入培养皿中,用少量无菌汉克斯平衡盐水溶液 (HBSS)和薄荷非常精细地用无菌剃须刀刀片。
- 将分散的细胞团转移到T25细胞培养瓶中,其中含有5 mL Dulbeco的改性鹰培养基或DMEM(4.5 g/L葡萄糖、苯红和L-谷氨酰胺),辅以50%胎儿牛血清或FBS和1%抗生素/抗霉菌溶液。在37°C下,在5%CO2和100%湿度的培养箱中生长细胞。
- 24-48小时后洗去非粘附细胞,用50%FBS和1%抗生素/抗菌溶液替换DMEM。将细胞返回到孵化器。
- 每 3 天更换一次液体培养介质。
- 当细胞是90%的汇入时,分裂或通过细胞。去除培养培养剂,用HBSS清洗粘附细胞(不含钙或镁)。用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液孵育细胞,在37°C下孵育1-5分钟,直到细胞被圆润和分离。稀释细胞1:10在新鲜的培养培养,并添加到一个新的烧瓶。T-25细胞培养瓶需要5-8 mL培养基,5mL的HBSS洗涤,1mL的胰蛋白酶-EDTA通过。将烧瓶返回到孵化器。
- 第一次通道后,将 FBS 浓度降低到 40%,第二次通道后降低 30%,第三次通道后降低 20%,最后为所有后续通道降低 10%。建立具有 10% FBS 的标准 DMEM 介质增长的过程需要四个通道和 2 - 8 个月。
-
一旦细胞系建立,通过转染针对mRNA或CRISPR的非必需基因的shRNA或CRISPR,改变疑似肿瘤基因的表达。
- 建立抗生素耐药稳定细胞系与单个克隆,通过西方印贝和/或RT-qPCR验证一致的结果,但是,瞬态转染可以工作,因为测定只需要22小时控制细胞系非特定的目标序列也是必需的。
2. 体外入侵测定
- 在T25烧瓶中生长粘附小鼠乳腺肿瘤细胞,直到实验第一天的70-90%融合。
注:其他细胞系或实验条件可能需要不同的细胞培养基。例如,如果正在测试激素反应性乳腺癌细胞,可能需要木炭过滤血清来去除激活雌激素或其他激素受体的化合物。 - 将 Boyden 室插入物加热至室温(从 -20°C 储存)在细胞培养罩中加热约 20 分钟,从而制备。避免未使用刀片的冻结-解冻周期。使用三个插入(复制)为每个实验的每个单元格线生成统计上有效的数据。
- 将预加热的37°C无血清DMEM介质加入井中,然后插入。对于专为 24 孔菜肴设计的刀片,向孔中加入 500 μL 无血清 DMEM,然后将 500 μL 无血清 DMEM 添加到插入件中,以便多孔膜和凝胶在两侧加水化。
注:对于专为 6 口盘设计的较大刀片,在两侧使用 2 mL 无血清 DMEM。
- 将预加热的37°C无血清DMEM介质加入井中,然后插入。对于专为 24 孔菜肴设计的刀片,向孔中加入 500 μL 无血清 DMEM,然后将 500 μL 无血清 DMEM 添加到插入件中,以便多孔膜和凝胶在两侧加水化。
- 将插入物的培养皿放入具有 5% CO2和 100% 湿度的细胞培养箱中,至少 2 小时,以彻底滋润和适应。
- 通过去除生长培养和用5 mL HBSS对细胞进行浸化来制备细胞。
- 取出HBSS,在37°C下加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液1-5分钟,或直到细胞出现圆形或出现脱离烧瓶的迹象。
- 轻轻敲击烧瓶以分离所有细胞。将细胞悬浮在5 mL的DMEM = 10%FBS中,并转移到无菌的15 mL离心管中。
- 在1,000 x g下离心细胞5分钟,轻轻颗粒细胞。取出介质,用5mL无血清DMEM替换,以重新悬浮细胞。
- 在无血清介质中重复离心和悬浮两次,共3次。
- 彻底重新悬浮无血清DMEM最后5 mL中的细胞,确保没有细胞团块。
- 使用血细胞计确定细胞浓度。只计算可行的单元格。在5mL的无血清DMEM中,将细胞悬浮液稀释至5 x 104细胞/mL。
注:这种浓度在24口盘中每插入2,500个细胞。这个数量的细胞对于具有高迁移和入侵率的侵略性癌细胞来说已经足够了。攻击性较低的细胞系可能需要更多的细胞,对于可观察的入侵细胞,每个细胞每次插入最多10,000个细胞。如果预期细胞入侵会减少,请考虑通过增加细胞数量来最大化入侵细胞。如果预期细胞入侵增加,则从较少的细胞开始。 - 从培养箱中取出细胞培养皿,然后轻轻地从插入物中吸出介质。提起刀片并从井中吸出介质。快速工作,将化学吸引剂添加到下腔室。对于 24 口菜,添加 750 μL 的 DMEM,带 5% 的 FBS。
- 将刀片放入井中,然后将单元格添加到插入件中。对于 24 孔盘,使用 500 μL 的细胞悬浮液。对于 6 口盘插入,使用 2.5 mL 的化学吸引和 2 mL 的细胞。确保膜两侧均无气泡。
- 将盘子返回到细胞培养箱22小时。
- 22小时后,修复并染色细胞。在1倍磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备1%的甲醛溶液进行固定。
- 在干净的24孔细胞培养皿中,向单个孔中加入1 mL的固定剂,以便每个插入有一个孔。
- 在 PBS 溶液中制备 0.1% 晶体紫色 (w/v) 的染色溶液(新鲜制成),使用 10% 乙醇 (v/v)。同样,在每个刀片的 24 口培养盘中,将 1 mL 的染色溶液添加到清洁井中。
- 用钳子一次取出每个刀片,并在刀片内放置无菌棉签,并在膜的上侧拭子以去除未迁移的细胞。
- 重复用第二个棉签。膜相当强,在擦拭时压力温和,不会损害膜的完整性。
- 从刀片内部取出所有剩余介质,并添加 750 μL 的 PBS 以洗去分离的细胞。
- 拆下 PBS 并重复洗涤。将插入物放入含有固定剂的井中,以固定膜底面的迁移细胞。对所有插入重复上述步骤。
- 在室温下将刀片固定 15 分钟。
- 固定后卸下刀片。用 750 μL PBS 再次清洗刀片。
- 将刀片放入井中,使用染色溶液染色所有迁移和固定的细胞。在室温下将细胞染色15分钟。
注:对于 6 口盘插入件,请使用 2 mL 的固定溶液、2 mL 染色溶液和 2 mL 的 PBS 洗涤液。
- 使用带蒸馏水的烧杯来脱色刀片。取出刀片并浸入蒸馏水中,直到从刀片中流出的水变清。
- 清除多余的水滴,将刀片侧移放在滤纸上,以晾干(通常过夜)。
- 通过为每个刀片标记干净的玻璃显微镜幻灯片,并在幻灯片中心放置一小滴显微镜浸入油,为成像准备膜。
- 使用手术刀将膜从刀片上分离,以切割塑料刀片内侧膜的周长。
- 使用钳子取下膜,并放置在滑道上的油滴顶部,使其保持到位。
注:膜非常薄,非常轻,因此很容易被温和的气流所丢失。
3. 成像和分析
- 由于多孔膜是清晰的,并且用水晶紫罗兰染色的细胞可以进行对比,因此使用复合光学显微镜观察细胞。使用相机和/或软件对许多样品进行量化,但没有必要。以 5 倍、10 倍或 20 倍的放大倍率查看单元格。对于量化,以 10 倍放大倍率使用多个非重叠图像。或者,以 10 倍的放大倍率计算膜上所有迁移的细胞。
- 确定所有样本每个区域的入侵细胞或细胞总数。对于每个实验,使用三个复制插入执行测定中的每个条件,并重复多次以产生统计上有用的结果。
- 当比较不同生长率和迁移率的不同细胞系时,做一个平行实验来比较通过蛋白质基质入侵的细胞,并与没有蛋白质基质的Boyden腔室组件进行比较(仅限迁移细胞)。计算每个细胞系的入侵百分比(入侵细胞数/迁移细胞数 x 100%)。
注:这种方法可以帮助将入侵率与迁移率进行比较。如果比较应用于同一细胞系的不同条件,仅计算入侵就更相关。膜的外边缘有时比中心区域有较多的细胞数量,因此精度较低。如果发生这种情况,从定量中排除这些细胞,并确保在重复实验中用棉签去除所有细胞。
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Representative Results
利用蛋白质基质进行体外入侵的方法,用锌指蛋白ZC3H88的表达改变,评估小鼠乳腺肿瘤细胞的侵略性表型和致致细胞行为。结合其他也检查细胞迁移和生长在3D环境中的方法,发现在肿瘤细胞系中Zc3h8的表达水平较高,或者通过质粒的启动子介导表达,导致细胞快速速率扩散,快速迁移,在3D环境中增长,并在体外入侵测定8增加入侵。相反,shRNA构造的表达减少导致攻击性扩散、迁移和入侵减少8。这些结果在体内得到证实,其中Zc3h8的较高表达产生更大的肿瘤,迅速出现,而减少表达产生较少的肿瘤,是更小和不太频繁的8。
为了扩大这一工作,能够挽救shRNA介导的Zc3h8表达的表达质粒在小鼠乳腺细胞中稳定地转染,以评估这些细胞中是否可以重新建立侵略性细胞生长和行为。所有敲击和救援的表情都验证了西方印贝或RT-qPCR 8。在24个井盘中,每个腔室有5000个细胞使用入侵测定,并记录有照片,如图1和图2所示。图3显示了入侵测定的结果,该结果表明,在shRNA敲除Zc3h8表达时,细胞入侵是如何减少的,但是当该表达被拯救时,入侵被拯救。这些数据表明,入侵检测可以提供一种快速的方法,在体外测试细胞系之前,开始更昂贵和漫长的方法。
图1:入侵测定组件。(A) 博伊登室插入24井组织培养盘.(B) 24井组织培养皿,用于在22小时孵育细胞后固定、染色和清洗。数字 1、2 和 3 是单个单元格线的复制。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:具有时间刻度的入侵测定流程图。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:小鼠乳腺肿瘤细胞的样本入侵测定结果改变为Zc3h8的表达,改变致癌表型。(A, B)从小鼠乳腺肿瘤分离的细胞通过shRNA以mRNA或Zc3h8 mRNA的对照序列进行稳定转染。(C) 后来的细胞系随后通过表达重组剂 Zc3h8 进行抢救,该细胞系设计不受 shRNA 影响。细胞被水晶紫罗兰染色,使用光学显微镜以10倍放大倍率捕获。刻度条 = 500 μm (D) 定量表明 Zc3h8 的表达减少减少了入侵细胞的数量和转移电位。基因表达的拯救可以挽救较高的细胞入侵率。值表示 24 井入侵测定插入的入侵单元格总数。对于实验中的每个复制,计算入侵细胞的平均数量。这在三个实验中重复。误差柱表示平均值的标准误差。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
体外入侵测定是研究促进癌细胞入侵的因素的一种廉价、快速、定量和直接的方法。乳腺癌是妇女中最常见的癌症。在乳腺癌的三个主要亚型中,三阴性,(或ER,PR-,HER2/neu-),是最具有攻击性的,最有可能转移,也是最致命的9。因此,了解导致转移的基因和表达有助于找到新的治疗靶点和遗传标记。虽然许多对癌细胞入侵和转移重要的基因已经确定和特征,转移驱动因素与转移抑制器的表达水平和活性可能是疾病进展9的一个关键方面, 10.
除了基因表达,体外入侵测定还用于研究微RNA和其他调节剂在促进或预防癌细胞入侵中的作用11,12。体外入侵设置方法可用于研究抑制剂、多细胞型肿瘤环境、CRISPR编辑细胞或细胞生长环境的短期变化。多功能性和适应性使这种测定非常有利。
入侵测定可用于分析有助于或防止肿瘤进展的基因和因素的第一步。例如,Yan等人(2010年)使用体外入侵测定来定义GATA-3在抑制EMT的作用,其作用是由极具攻击性的乳腺癌细胞系MDA-MB 23113。然后,他们能够证明,这种抑制与在体内测定13中形成转移的能力下降有关。潜在的治疗策略可以初步的特点是通路抑制剂通过Matrigel限制入侵的能力,也与这些抑制剂在动物模型中对肿瘤形成的影响有关。体外入侵测定可用于对已知和潜在的肿瘤基因和相互作用的伙伴进行更深入的分析。例如,对蛋白的已知功能图案进行分子解剖或快速分析突变,可以通过体外入侵测定作为初始屏幕或评估重要性。这可以提供对关键领域的宝贵见解,以及在分子水平上对细胞表型的功能理解。
虽然博伊登室入侵测定有许多优点,但也有局限性。例如,入侵测定只看内血管转移,转移的初始步骤之一,而不是当癌细胞殖民二次位置的后期步骤。因此,只能得出转移潜力的部分观点。22 h 的测定长度虽然是灵活的,但不能排除某些细胞分裂,这些细胞分裂可能会扭曲异步细胞群入侵时的细微变化。在快速潜水细胞的情况下,Mitomycin C等抑制剂可用于防止细胞分裂。最后,使用5%的FBS溶液进行化学治疗将随着时间的推移缓慢扩散,并在上下腔间平衡。蛋白凝胶的密度减缓了这种扩散,使细胞可以选择在凝胶和膜(血管轴)上横向迁移,或通过蛋白质基质通过孔隙向FBS(化学片)的较高浓度迁移。替代化学制剂可以替代或缩短入侵的时间允许,仅用于测量在平衡之前入侵的细胞。体外入侵测定的灵活性,而不是刚度,使得这种测定非常有用。这种测定的未来适应包括大规模筛选化合物、基因表达变化以及评估等位基因特异性药物有效性。此外,具有循环介质的双腔系统可以挑战细胞通过蛋白质基质入侵,穿越液体环境,并在二级位置在第二个蛋白质基质上重建。最后,更具挑战性的膜可用于体外入侵检测系统,如非侵入性细胞的单层,癌细胞更难交叉。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究院的R15CA169978资助。额外的资金来自维拉诺瓦大学。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
References
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