Summary
Sperm skal med held navigere gennem ovikanalen for at gøde en oocyte. Her beskriver vi en analyse til måling af sædmigration inden for C. elegans hermafrodit livmoderen. Denne analyse kan give kvantitative data om sædfordelingen i livmoderen efter parring, samt om hastighed, retningsbestemt hastighed, og reversering frekvens.
Abstract
Vellykket befrugtning er grundlæggende for seksuel reproduktion, men kun lidt er kendt om de mekanismer, der fører sperm til oocytter i den kvindelige reproduktive tarmkanalen. Mens in vitro undersøgelser tyder på, at sperm af internt befrugtende dyr kan reagere på forskellige stikord fra deres omgivelser, den manglende evne til at visualisere deres adfærd inde i den kvindelige reproduktive tarmkanalen skaber en udfordring for forståelsen sperm migration og mobilitet i det oprindelige miljø. Her beskriver vi en metode ved hjælp af C. elegans , der overvinder denne begrænsning og udnytter deres transparente epidermis. C. elegans mænd plettet med en mitokondrie farvestof er parret med voksne hermaphrodites, der fungerer som modificerede hunner, og deponere optælling mærket sperm i hermafrodit livmoderen. Migrationen og motiliteten af den mærkede sperm kan derefter spores direkte ved hjælp af et EPI-fluorescens mikroskop i et levende hermaphrodite. I vild-type dyr, ca 90% af den mærkede sperm kravle gennem livmoderen og nå befrugtning stedet, eller spermatheca. Billeder af livmoderen kan tages 1 h efter parring for at vurdere fordelingen af sædcellerne i livmoderen og den procentdel af sædceller, der har nået spermatheca. Alternativt kan time-lapse billeder tages umiddelbart efter parring for at vurdere sædhastighed, retningsbestemt hastighed og reversering frekvens. Denne metode kan kombineres med andre genetiske og molekylære værktøjer til rådighed for C. elegans at identificere nye genetiske og molekylære mekanismer, der er vigtige i reguleringen af sperm vejledning og motilitet i den kvindelige reproduktive tarmkanalen.
Introduction
De molekylære mekanismer, som spermatozoer (benævnt sperm) navigere gennem den kvindelige reproduktive tarmkanalen mod oocyt er ikke godt forstået, men er grundlæggende for seksuel reproduktion. Sperm motilitet er meget dynamisk og afhænger af robuste kommunikationssignaler, der ændrer sædhastigheden og retningsbestemt motilitet1,2,3,4,5,6 , 7 af , 8 ud af , 9 ud af , 10 stk. , 11 af , 12. C. elegans er blevet en kraftfuld model for at studere sædbevægelse in vivo, fordi hermaphrodite gennemsigtige epidermis tillader sporing af levende sperm ved enkelt celle opløsning2,3, 8,10. Formålet med dette dokument er at give metoder til vurdering af sædbevægelser inden for C. elegans hermafrodit livmoderen.
I dyrearter, hvor sperm og oocyt mødes i det ydre miljø (dvs., elementers vandløbs miljøer), sædceller reagere på chemotaktiske signaler udskilles af oocytter. Disse signaler guide retningen af sædceller bevægelse, bringe dem tættere på signalkilde4,6,11. Men, meget mindre er kendt om sperm bevægelse i arter, der gøder internt. En stor udfordring er arkitekturen i den kvindelige reproduktive tarmkanalen, som er utilgængelige for mikroskopi i de fleste arter. In vitro undersøgelser hos mennesker, mus og grise, for eksempel, giver dokumentation for, at subpopulationer af sædceller kan reagere på chemoattraktanter, fluid flow, og termiske gradienter1,5,7,9, 12. i. Med disse systemer, manglende evne til at visualisere og spore sperm bevægelse in vivo placerer alvorlige begrænsninger på strategier til at opdage de centrale mekanismer, der regulerer disse funktioner.
For at overvinde disse begrænsninger, har vi udviklet metoder ved hjælp af fyrretræsnematoden C. elegans til direkte visualisere sædceller efter insemination, til at måle individuelle sperm migration parametre in vivo, og til at måle evnen af en sædpopulation til at målrette fertiliserings stedet. Disse metoder, sammen med C. elegans molekylære og genetiske værktøjsæt, lette opdagelsen af de kemiske signalering molekyler og molekylære maskiner, der regulerer sperm motilitet adfærd. For eksempel kan genetiske skærme udføres i hermafroditter eller hanner til at identificere gener, der er afgørende for effektiv sædbevægelse in vivo13. Molekyler kan injiceres i hermafrodit gonad til at teste for effekter på sperm aktivering, migration hastighed, og retningsbestemt motilitet3. Derudover, de beskrevne metoder kan bruges til at overvåge rogue sperm migration i ektopisk krop steder og til at evaluere sperm konkurrence10,14.
C. elegans findes i naturen som hermafroditter og hanner (Se figur 1). Den hermafrodit gonad har to U-formede arme, der er spejlbilleder af hinanden. I L4-larvestadiet gennemgår de mest proximale kimceller (dvs. cellerne i nærheden af spermatheca) spermatogenesen. Hver primær spermatocyte kommer ind i meiose og producerer fire haploide spermatider. Disse spermatider er skubbet ind i spermatheca sammen med den første modne oocyt og undergår spermiogenesis15. Voksne hermafroditter skifte fra spermatogenesen til oogenesis. Oocytterne modnes i en samlebånds mode langs gonaden, med den mest modne oocyt i den proximale ende af gonaden, ved siden af spermatheca. MSP-signaler fra sæden er nødvendig for at udløse meiotisk modning og ægløsning16,17. Mand C. elegans, på den anden side, har en J-formet gonad, der producerer kun sperm. Spermatiderne opbevares i den skelsættende vesikel. Efter parring med hermafrodit eller kvinde, den mandlige indsætter Splinter nær halen i vulva. Spermatider aktiveres under sædafgang, når de kommer i kontakt med sædvæsken18. C. elegans sperm ikke svømme, da de ikke er flagelleret. I stedet, de kravle gennem reproduktions vejene, ved hjælp af pseudopod for bevægelse. Det er veletableret, at mandlige sædceller, som er større i størrelse, har en konkurrencemæssig fordel i forhold til hermafrodit sperm14.
I denne metode fungerer mandlige C. elegans som sæddonor og er parret med voksne hermaprhodites. Voksne hanner er plettet med en fluorescerende mitokondriel farvestof til produceret mærket sperm. Når deponeret gennem hermafrodit vulva, skal sæden kravle rundt om embryonerne i livmoderen mod spermatheca, eller befrugtning site. Den gennemsigtige epidermis af C. elegans model giver mulighed for direkte visualisering af hver enkelt sædceller, da det navigerer gennem den kvindelige reproduktive tarmkanalen. I de seneste år har vores laboratorium med succes brugt denne metode til at demonstrere vigtigheden af en klasse af F-serien prostaglandiner i ledende sperm fra vulva til spermatheca19,20. De molekylære mekanisim, der styrer dens syntese af hermafrodit og reaktionen fra sædcellerne, er stadig under efterforskning. Men denne metode til vurdering af sperm motilitet og migration i høj grad letter identifikationen af de vigtigste aktører, der kontrollerer sperm og oocyt kommunikation i internt befrugtning dyr. Følgende protokol beskriver trin for trin, hvordan du udfører denne analyse.
Protocol
Bemærk: alle trin i denne protokol udføres ved stuetemperatur (~ 20-22 °C) eller i kuvøser med konstant temperatur indstillet til 16 °C eller 20 °C. Mandlige og hermafrodit C. elegans dyrkes ved hjælp af standard dyrkningsbetingelser og NA22 eller OP50 E. coli som fødekilde21,22. Wild-type N2 hermafroditter og Fog-2 (q71) mænd anvendes i proceduren nedenfor.
1. dag 1: plukke L4 Stage Hermaphrodites til parring
- For at opnå ensartede resultater, bør alle hermafroditter synkroniseres som aktivt reproducere voksne. Pick 20-30 L4 fase hermafroditter til en 6 cm seedede fyrretræsnematoden vækstmedium (NGM) plade. Der inkuberes hermafrodites ved 20 °C i 28-30 h.
Bemærk: Kun 12-15 hermafroditter vil blive brugt til parring. De resterende hermafroditter er overskud.
2. dag 1: farvning af hanner med fluorescerende mitokondriel farvestof (Mito-Dye)
- Lav en mandlig farvning plade ved at placere en prik af E. coli (mad prik) i midten af en useedet NGM plade. For at gøre maden prik, bruge enden af en glas omrøring stang til at skrabe e. coli fra bakterien græsplæne af en seedet plade og deponere det på den useeded plade. Prikken skal være ~ 5-7 mm i diameter.
- Bland 2 μL 1 mM Mito-farvestof (Se tabel over materialer) i DMSO og 10 μl M9 buffer (3 g KH2po4, 6 g na2HPO4,5g NaCl, 1 ml 1 M mgso4, H2O til 1 L. Tilsæt mgso4 efter autoklavering). Afpipettér alle Mito-farve opløsningen på madprikken på den mandlige farvnings plade. Lad pladen tørre i mørke (~ 30 min).
Bemærk: Mito-farvestof er lysfølsomt. Skjold alle opløsninger, plader og orme, der indeholder Mito-farvestof fra lys. Opbevar 1 mM-lageret ved-20 °C. - Pick ~ 100 1-3 dag gamle voksne mænd23 til Mito-Dye farvede mad prik på den mandlige farvning plade. Pak pladen i aluminiumsfolie og inkube natten ved 16 °C. For parring, brug ~ 50-60 hanner per 12-15 hermaphrodites. Hvis mere end ~ 100 hanner er nødvendige, gøre mere farvning plader for at forhindre overbelægning af mænd.
Bemærk: Hannerne kan også blive plettet ved at inkuere i en 10 μM Mito-farveopløsning i M9 buffer til 3 timer på et urglas. Hold ormene dækket for at forhindre fordampning og let eksponering. Efter 3 timer skal du bruge en Pasteur-pipet til at overføre hanner til en 10 cm seedede NGM-plade. Overfør så lidt af Mito-farve opløsningen som muligt. Pak pladen i aluminiumsfolie og inkube natten over i 16 °C.
3. dag 2: parring
- Vælg de farvede hanner fra dag 1 på en ny, seedet NGM-plade. Lad pladen være i mørke indtil parring. Dette trin sikrer, at overskydende Mito-Dye farvede bakterier omkring hannerne fjernes. Overførsel af overdreven Mito-Dye farvede bakterier på parring pladen kan plette hermafrodit væv.
- Lav en parring plade ved at droppe 2 μL af en tyk E. coli blanding på en ikke-SEEDET NGM plade. Lad de tykke bakterier tørre for at gøre parring prik. Hanner og hermafroditter vil blive overført på denne prik for parring. For at gøre tyk e. coli, spin ned 3 ml natten E. coli og resuspension bakterie pellet i 1 ml M9. Denne blanding kan opbevares ved 4 °C og genbruges i op til 6 måneder.
Bemærk: Tykkelsen af E. coli -opløsningen kan justeres. Hvis opløsningen er for tynd, kan hannerne kravle væk fra parring prikken i stedet for at aggregere den til parring. Parring prikker lavet af en E. coli soluton, der er for tyk kan mindske parring effektivitet. - Mens parring plade fra trin 3,2 er tørring, blandes sammen 300 μL af 1% (w/v) Tricaine (Tri), 300 μL af 0,1% (w/v) Tetramisole (tet), og 900 μL af M9.
Bemærk: Opbevar 1% (w/v) Tricaine og 0,1% (w/v) Tetramisole som aliquotes ved-20 °C. Undgå gentagne fryse tø. - Overfør 600 μL af tet/Tri-opløsningen til et urglas.
- Transfer 12-15 hermafroditter plukket på dag 1 til tet/Tri løsning i urglasset. Inkube i 30 min til at immobilisere hermaphrodites. Hold urglasset dækket for at forhindre, at tet/Tri-opløsningen fordøvere.
Bemærk: Det er vigtigt, at hermafroditter bedøvet i mindst 30 min. mindre tid kan resultere i en bevægende orm under billed erhvervelse, som kan interefere med Imaging. - Mens hermafroditter inkuerer, pick 50-60 farvede hanner fra trin 3,1 på parring prik (trin 3,2). Opbevar pladen i mørke indtil trin 3,8.
- Efter 30 min inkubation i tet/Tri-opløsningen skal du bruge et glas Pasteur-pipet til at overføre de immobiliserede hermafroditter fra urglasset til en useedet NGM-plade. Fjern så meget væske som muligt, og lad den overskydende væske tørre.
Bemærk: Lad ikke hermafroditter tørre alt for meget. Så snart al synlig væske er fordampet, skal du begynde næste trin. - Overfør de anæstetiserede hermafroditter fra den useedet NGM-plade til parring prik med de farvede hanner. Inkube i mørket i 30 min for at tillade hannerne at parre sig med hermaphrodites.
- Efter parring i 30 min, montere hermafroditter straks for time-lapse Imaging eller overføre hermafroditter på en ny, seedet NGM plade til hvile i 1 time før Imaging.
Bemærk: Time-lapse videoer af hermafrodit livmoderen bruges til at kvantificere sædhastighed og reversering frekvens. Stillbilleder af livmoderen taget 1 h efter parring bruges til at kvantificere sædfordelingen, eller spem vejledning.
4. dag 2: monterings orme til visualisering
-
Oprettelse af en monterings pude med 2% agopstået i H2O
Bemærk: 2% agopstået kan foretages i løs vægt, aliciteres i glas Prøvekør og opbevares ved 4 °c. Når det er nødvendigt, kan hver alikvot mikrovinsyre før hver brug og opbevares i en varmeblok for at forhindre, at den størkner.- For at gøre monterings puden, justere tre glas mikroskop dias side om side med de lange kanter rørende. Anbring to stykker afmasknings tape oven på hinanden på begge de udvendige slides. Disse udvendige glas slides med tape vil fungere som støtte, så tykkelsen af den resulterende agopstået pad vil være "to tape dybe".
- Sted ~ 75 μL smeltede 2% agopstod på midterdiaset (dette er diaset uden tape). Anbring straks et nyt glas mikroskop på toppen af agopstået. Dette øverste glas slide skal være vinkelret på de andre dias, med hver ende hviler på båndet af de to støtte dias.
- Lad agopstod hærde (~ 30 s). Fjern forsigtigt det øverste glas slide ved at skubbe det ud af den agopstået pad.
- Der anbringes 10-15 μL af tet/Tri-opløsningen på 2% agopstået pad. Overfør de parret hermafroditter på puden. Vær omhyggelig med at overføre så lidt bakterier som muligt.
- Anbring en cover seddel over ormene på agopstået pad.
5. dag 2: Opsætning af billed anskaffelse
Bemærk: Ethvert opretstående miscroskop udstyret med EPI-fluorescens, 10x og 60x mål, og et digitalt kamera kan bruges til at erhverve billeder til sæddistribution. Software, der er i stand til at erhverve tids-bortfaldne billeder er nødvendige for at vurdere sædhastighed, retningsbestemt hastighed, og reversering frekvens.
-
Billede erhvervelse 1 h efter parring
- Monter sliden på mikroskop scenen. Kig gennem øjet stykker for at scanne for orme på agopstået pad ved hjælp af 10x mål med det røde fluorescens emissions filter (TRITC filter). Når en orm er fundet, skal du kortvarigt tænde for fluorescens lys for at se, om ormen er parret. Hvis sperm er synlig i livmoderen, skifte til 60x mål.
Bemærk: Trykket skabt af 60x målet på dækglas kan beskadige nogle skrøbelige orme, hvilket får tarmen eller gonaden til at Ekstruderer fra dyret. Scanning for vellykket parring ved hjælp af 10x mål kan minimere orme ' eksponering for det ekstra tryk. Udsæt ikke de parret orme for længere perioder med fluorescerende lys. - Brug differentiale interferens kontrast mikroskopi (DIC), placere ormen, så både vulva og en spermatheca er i betragtning. Fokuser billedet ved at fokusere på centrum af spermatheca. Kontroller eksponeringen for både DIC-og TRITC-kanaler. I DIC bør interne orme strukturer være tydeligt synlige. I TRITC bør individuelle sædceller være synlige som særskilte puncta.
Bemærk: Hvert billede skal indfange livmoderen fra vulva til en af spermatheca. Hvis livmoderen er for lang til at passe på et billede, kan to separate billeder tages. Det er ikke nødvendigt, at alle billederne tages på samme eksponeringsniveau. Det er dog vigtigt, at de enkelte sædceller kan skelnes og kvantificeres i fluorescens billeder. - Erhverve DIC og fluorescens billeder for hver livmoder.
- Gentag trin 5.1.1-5.1.3, indtil alle parrede hermafroditter er blevet indpakket.
- Monter sliden på mikroskop scenen. Kig gennem øjet stykker for at scanne for orme på agopstået pad ved hjælp af 10x mål med det røde fluorescens emissions filter (TRITC filter). Når en orm er fundet, skal du kortvarigt tænde for fluorescens lys for at se, om ormen er parret. Hvis sperm er synlig i livmoderen, skifte til 60x mål.
-
Optagelse af timelapse-videoer
- Scan agrose pad og lokalisere hermafroditter, der indeholder mærket sperm i livmoderen, som beskrevet i trin 5.1.1 og 5.1.2
- Konfigurer softwaren til at hente tidsforskydningbilleder i DIC-og TRITC-kanaler. Generelt, time-lapse billeder er taget på 15-30 s intervaller for 10-20 min per livmoderen.
6. kvantificering
-
Kvantificering af sædfordelingen på livmoderen billeder taget 1 h efter parring
- Begyndende med vulva på den ene ende og spermatheca på den anden, opdele livmoderen i tredjedele. Disse vil repræsentere de tre zoner. Zone 1 (Z1) indeholder vulva og zone 3 (Z3) indeholder spermatheca.
- Manuelt tælle antallet af sædceller inden for hver tredjedel af livmoderen, og rapportere antallet i hver zone som en procentdel af den samlede sperm i hele livmoderen. Et eksempel er angivet nedenfor.
Bemærk: nogle gange skal signal intensiteten af TRITC-kanal billedet justeres, så hver sædcelle, der er fanget i billedet, kan ses og kvantificeres.
-
Sporing af sæd i tidsforløbs billeder
Bemærk: I dette papir brugte vi NIS-Elements software til analyse. I afsnittene nedenfor giver vi instruktioner til manuel sporing af sperm ved hjælp af denne software (trin 6.2.1) samt open source-softwaren ImageJ/Fiji (trin 6.2.2).-
Sporing af sperm med NIS-Elements
- Åbn. Sd2-filen med timelapse-serien, der skal spores. For at begynde at spore skal du åbne sporings panelet ved at højreklikke i softwaren og vælge analyse kontrolelementer | Jeg sporer.
- Vælg Definer nyt investeringsafkasti sporings panelet. Definer hver region af interesse (ROI) ved at klikke over hver sædceller, der vil blive sporet. Der vises et farvet mærke over den valgte sædcelle. Klik på Udfør , når alle Rois er valgt.
- Når ROIs er blevet identificeret, skal du flytte til den næste ramme i timelapse-serien. Træk ROI-markøren til den nye placering af sædcellerne i billedet. Fortsæt med at gøre dette, indtil sædcellerne ikke længere kan spores. Stiplede linjer vil blive vist, der forbinder hver af de steder, ROI markør er blevet placeret gennem alle frames af tidsforskudt billede.
Bemærk: Kun sperm i zone 2 skal spores, da sædceller i zonerne 1 og 3 har tendens til at bevæge sig i et cirkulært mønster selv i vilde dyr. - Eksportér alle kvantificerbare data (f. eks. stiens længde, tid, XY-position osv.) fra den sporede sperm til et Excel-dokument ved at klikke på Eksporter i sporings panelet.
-
Sporing sperm med Fiji
- Konverter TRITC-kanal billederne i timelapse-serien til. tif-filer. Gem alle filer fra en serie i én mappe.
- Importer billederne til Fiji ved hjælp af funktionen Bioformaters import. Importer billeder fra én tidsforskudt serie som én hyperstack.
- Åbn track Mate i Fiji24 via plugins | Sporing af | Manuel sporing med track Mate. En diaglogue boks åbnes.
- Vælg værktøjet track Mate på Fiji-værktøjslinjen. Dobbeltklik på den sperm, der vil blive sporet. Der vises en grøn cirkel med stiplede linjer. Denne cirkel kan omplaceres ved at klikke inde i cirklen og trække til den ønskede position. Størrelsen på denne cirkel kan ændres ved samtidig at trykke på alt -tasten og rulle med musen.
- Når størrelsen og placeringen af trackeren er indstillet, skal du klikke på cirklen igen. De stiplede grønne linjer bliver til en solid grøn linje. Samtidigt slå den skifte og L nøgler hen til omdrejning oven på inddeling måde. Dette vil blive angivet i Fiji værktøjslinjen.
- Flytte til den næste ramme i timelapse-serien. Hvis du vil angive den nye placering af den sporede sperm i den nye ramme, skal du holde musen over det nye punkt og trykke på A -tasten. Trackeren vil nu blive vist på den nye placering, og der vises en linje, der forbinder de steder, hvor trackeren er placeret i de foregående rammer.
- Når sporene er afsluttet, skal du klikke på Analysér i dialogboksen track mate for at generere de nødvendige data.
- For at beregne hastigheden, divideres den samlede kurve længde af sædcellerne med den forløbne tid.
- For at beregne vektoriteten hastighed, tegne en linje gennem livmoderen begyndende fra vulva peger mod spermatheca. Mål den afstand, som sædcellerne har migreret langs denne linje fra begyndelsen til slutningen af sporingen. Dividerer denne afstand med den forløbne tid. Negative værdier indikerer, at sæden er migreret væk fra spermatheca.
- Hvis du vil registrere tilbageførselsfrekvensen, skal du tælle antallet af gange, hvor sædsporet har genereret en vinkel på mindre end 90 ° i tre på hinanden følgende tidsforløbs rammer.
-
Sporing af sperm med NIS-Elements
Representative Results
For at generere resultaterne afbildet i dette papir, tåge-2 (q71) mænd blev plettet med Mito-Dye og parret til Wild-type, N2 hermaphrodites. Figur 2 indeholder en overordnet ordning for metoden, herunder forberedelse af orme, parring og analyse. Som film 1 viser, den voksne hermafrodit reproduktive tarmkanalen har to arme, der er spejlbilleder af hinanden. Ved parring, mærkede sædceller deponeres i hermafrodit livmoderen gennem vulva. Sædcellerne bevæge sig rundt i udviklingen af embryoner i livmoderen mod spermatheca, hvor de opbevares indtil befrugtning. Som kimceller i den voksne hermafrodit udvikle sig til oocytter, den proksimale, mest modne oocyt skubbes ind i spermatheca via kappe celle contrations. Befrugtning sker, mens oocyt er i spermatheca.
For at kvantificere sperm fordeling og migration gennem den kvindelige reproduktive tarmkanalen, er hermafrodit livmoderen opdelt i tre zoner (film 1, figur 3a). Zone 1 strækker sig over den første tredjedel af livmoderen, begyndende fra vulva. Zone 2 spænder over den midterste tredjedel af livmoderen, og zone 3 strækker sig over den sidste tredjedel af livmoderen og omfatter spermatheca. Korrekt sperm vejledning ved hjælp af Wild-type, N2 hermafroditter og Fog-2 (q71) hanner bør resultere i ca. 90% af den mærkede sæd, der når spermatheca, eller zone 3 (figur 3b). Matings, der resulterer i for få (figur 3c, mindre end 10-15 sperm) eller for mange (figur 3D, livmoderen fyldt med sperm) sperm i livmoderen bør ikke tælles. I parring, der resulterer i mindre end 10-15 sperm, 3-4 rogue sperm kan stærkt skævvride data. På samme måde, når livmoderen fyldes helt med sperm, kan sæden ikke migrere korrekt. Sperm kan synes spredt over hele uteri af nogle mutanter, der udviser dårlig sperm vejledning fænotype. Men, i dette tilfælde, sperm bør ikke fylde hver sprække af livmoderen, som det ses i figur 3D. Kvantificering af hver af gonadens arme betragtes som en prøve eller en n.
Time-lapse billeder er taget for at kvantificere sædhastighed og reversering frekvens. Kun sperm i zone 2 skal spores (figur 4a), fordi sperm i zonerne 1 og 3 (film 1) har tendens til at bevæge sig i et cirkulært mønster selv inden for vilde dyr. Time-laspe billeder taget ved 15-30 s intervaller er normalt bruges til at spore sædceller. Kun sperm, der kan følges i sammenhængende rammer for mere end 2,5-3 min er kvantificeret. I figur 4b-M, den sperm markeret med de røde og blå prikker opfylder dette kriterium, mens sperm markeret med den grønne prik ikke. Derfor er de værdier, der er defineret i figur 4N , kvantificeret for sædcellerne markeret med de røde og blå prikker (figur 4o), mens de for sædcellerne, der er markeret med den grønne prik, ikke blev kvantificeret.
Figur 1: tegneserie af den voksne C. elegans hermafrodit og mandlige. Store reproduktive strukturer er mærket i figuren. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk diagram over prøveforberedelse og dataindsamling. Hanner farvet med Mito-Dye er parret til synkroniserede voksne hermaphrodites. Time-lapse billeder af parret hermafroditter tages umiddelbart efter parring at fange data for sædhastighed og reversering frekvens. Stillbilleder af parret hermafroditter tages 1 time efter parring for at vurdere sædfordelingen i livmoderen. Se teksten for at få flere oplysninger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: kvantificering af sædfordelingen inden for hermafrodit livmoderen. (A). skematisk af C. elegans hermafrodit livmoderen. V = vulva, E = embryo, S = spermatheca, O = oocyt, Z1-Z3 = zone 1-3 bruges til at måle sædfordelingen. (B-D). DIC + tritc fusioneret (venstre paneler) og tritc kun (højre paneler) billeder af Wild-type hermafrodit Uteri 1 h efter parring til tåge-2 (q71) mænd farvet med Mito-farvestof. Sperm vises rødt. Gule konturer indikerer placeringen af spermatheca. Skala stang: 20 μm. Z1, Z2, Z3 kvantificering i B repræsenterer procentdelen af sædcellerne i hver zone ± standardafvigelse. Billeder i C og D repræsenterer parringer, der har resulteret i for få (c) eller for mange (D) sædceller til kvantificering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: kvantificering af sædhastigheden og reversering af frekvensen under migrationen gennem livmoderen. (A). dic + tritc fusioneret billede af en hermafrodit livmoder indeholdende fluorescerende sperm (rød). V = vulva, gul = spermatheca, Z1-Z3 = tre zoner i livmoderen, sort boks: zone 2. (B-M). Time-lapse TRITC-kanal billeder zoomet ind på zone 2 (sort boks i A). Billeder blev anskaffet med 20 s intervaller. 3 individuelle sædceller blev sporet i hvert billede (rød, grøn og blå prikker). Farvede prikker i panel M repræsenterer stien til hver sædcelle fra B-L. Skaleringsbar = 20μm. (N). ligninger og definitioner for sædhastighed, vektor hastighed og reversering frekvens. (O). hastighed, vektorisering hastighed og reversering hyppigheden af sædceller sporet i paneler B-L af de røde og blå prikker. Klik her for at se en større version af dette tal.
Film 1: film af sædceller bevægelse og migration. En dværg hermafrodit blev parret til Fog-2 (q71) hanner farvet med Mito-farvestof. Filmen er en sammensat af time-lapse billeder taget med forskellige tidsintervaller. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Discussion
Evnen af sperm til at navigere den indviklede kvindelige reproduktive tarmkanalen og finde oocytter er afgørende for seksuel reproduktion. Nylige undersøgelser ved hjælp af sperm af internt befrugtende dyr tyder på, at de aktivt reagerer på forskellige Miljøsignaler, herunder kemisk signal, fluid flow, og temperaturgradienter1,5,7, 9 ud af , 12. disse observationer er dog stort set resultatet af in vitro eksperimenter og lidt vides om sædadfærd og kommunikation i reproduktions vejene. En af de største hindringer for at erhverve in vivo-data om sædmigration og motilitet er den manglende synlighed i de fleste kvindelige reproduktions skrifter. Den metode, vi har beskrevet her ved hjælp af C. elegans overvinder denne begrænsning. Som de repræsentative resultater demonstrere, den gennemsigtige epidermis giver mulighed for direkte visualisering og sporing af hver sædceller ved enkelt celle opløsning i en levende, intakt organisme.
C. elegans har to køn. Hannerne, med en XO genotype, producerer kun sperm, og i denne metode, der anvendes som sæddonorer. Hermaphrodite, med en XX genotype, er modificeret hunner. Deres gonader gennemgår først spermatogenesen under den fjerde larve fase og skifter til oogenesis i voksenalderen25. Denne analyse bruger voksne hermaphrodites, hvis reproduktive væv giver en model for den kvindelige reproduktive tarmkanalen. Udnyttelsen af begge køn i denne analyse giver os mulighed for at identificere genetiske og molekylære veje i både den mandlige og kvindelige, der kan regulere sperm vejledning og motilitet. Kombineret med hele væld af genetiske og molekylære teknikker til rådighed for C. elegans, denne metode kan føre til nye indblik i sædkvalitet migration og motilitet samt sperm og oocyt kommunikation.
Et par kritiske skridt i denne protokol berettiger yderligere overvejelse, ud over de oplysninger, der er fastsat i protokollen afsnit.
Orme
Fog-2 (q71), him-5 (e1490)eller him-8 (e1489) mutant hanner kan anvendes i stedet for N2 mænd. Disse mutationer øger hyppigheden af mænd i kulturer, men påvirker ikke mandlig parring eller sperm funktioner13. Kvinder, såsom tåge-2 (q71) kvinder, kan anvendes i stedet for hermaphrodites. Men, hunnerne skal være præ-parret med mænd til at tillade ordentlig oocyt udvikling. Tilstedeværelsen af befrugtede embryoner fra denne præ-parring sikrer også, at livmoderen er lang nok til korrekt vurdering sædfordelingen. Hvis mutant eller eksperimentelle hermafroditter er ved at blive vurderet, omfatte en kontrolgruppe (r). For eksempel bør mutant hermafroditter kombineres med dværg N2 hermafroditter som en kontrol for andre variabler i analysen. Hermaphrodites, der er blevet fodret med bakterier, der indeholder plasmider til RNA-interferens analyser, bør også fodres med bakterier, der indeholder Tom vektorkontrol. Afstanden fra vulva, hvor sperm er inseminated, at spermatheca, gødskning stedet, kan variere afhængigt af antallet af æg i livmoderen (dvs., livmoderen udvider med stigende ægnummer). Hvis der foretages sammenligninger mellem genotyper, skal du vælge hermafroditter, hvis uteri indeholder lignende antal æg. Undlad at vælge hermafroditter, der indeholder ruge embryoner eller bevægende larver. En tid kursus kan udføres for at identificere den optimale alder, hvor hermafroditter bør analyseres.
Picking hermafroditter og hanner
Det er vigtigt, at hermafroditter plukket til denne analyse er ikke fra over groede eller sultede plader. Mad og feromon stikord modulere udtrykket af DAF-7, en TGFß homolog. DAF-7 pathway er blevet vist regulere syntesen af F-serien prostaglandiner, der spiller vigtige roller i at vejlede sperm til spermatheca20. Picking hermafroditter fra overfyldte eller sultede plader kan resultere i dårlig sperm vejledning ikke er relateret til målet af interesse. Tætheden af pladerne synes ikke at påvirke den mandlige sædceller. Men, mænd, der er for ung eller for gammel kan resultere i nedsat parring effektivitet (dvs., procentdelen af hermafroditter på parring plade, der har nok sperm i deres uteri at kvantificere). 1-3 dag gamle voksne mænd er optimale til denne analyse23.
Anæstetiserende hermafroditter
I vores hænder sikrer Tetramisole-og Tricaine-kombinationen, at orme er immobiliseret og forbliver i live under parring og billed erhvervelse. Andre anæstetika, såsom natrium Azid, kan også anvendes. Men, natrium Azid er meget giftigt og betingelser skal være standardiseret. Immobiliserings teknikker ved hjælp af mikroperler, agopstået, og microfluidics kamre anbefales ikke, da de forstyrrer parring.
Mandlig farvning
Den Mito-farve, der anvendes i dette manuskript, MitoTrackerCMXRos, har været meget anvendt til mærkning af sperm, samt andre mitokondrier, i C. elegans. Den sperm mærket med denne Mito-Dye er fuldt funktionel, bevarer sin evne til at blive aktiveret, migrere, gøde oocytter, og producere levedygtige afkom26,27. Andre mitokondrie farvestoffer, såsom rhodamin 6G og DiOC6 er blevet brugt til at plette C. elegans mitokondrier28,29. Men, betingelser for disse farvestoffer skal være standardiseret for mærkning sperm i denne analyse. Ud over mitochrondrial mærknings mekanismer, kan DNA-pletter, såsom Syto17, også bruges til at mærke sperm for migration analyser30. Mens disse mærknings teknikker er relativt nemme og hurtige at udføre, kan transgene strategier også anvendes til at generere sperm, der udtrykker fluorescerende Tags under sperm specifikke promotorer31,32.
Parring
Parring af prikker, der er for tykke, kan reducere parnings effektiviteten. Der bør udvises forsigtighed for at overføre så lidt bakterier som muligt, når du flytter hanner og bedøvet hermafroditter på parring prik.
Fremstilling af betrækket puder og anbringelse af Cover sedlen
Luftbobler kan genereres i agopstået puder. De kan refragere lys under billed erhvervelse eller, når den er stor nok, forårsage orme til at falde igennem, hvilket gør det umuligt at erhverve billedet (r). På samme måde kan der dannes luftbobler langs hermaphroditterne, når Cover sedlen anbringes over dem på agopstået pad. Disse bobler afbøje lys og føre til nedsat billedkvalitet. Øvelse vil hjælpe med at mindske forekomsten af luftbobler.
Kvantificering
Ved kvantificering af sædfordelingen kan forskellige z-fly gennem livmoderen i en orm have små forskelle i sædfordelingen. Vi finder, at tage et enkelt billede fokuseret på spermatheca giver os reproducerbare resultater, der svarer til resultater opnået ved at gennemsnit flere z-sektioner. Vi anbefaler at fokusere billedet på midten af spermatheca, men de brændings planer kan ændres lidt baseret på experimenter behov. Det er imidlertid afgørende, at alle billeder tages på samme måde. Desuden er det vigtigt, at kun sædceller, der er i fokus, tælles. Det er modparts skøn ved fastlæggelsen af kriterierne for in-Focus sædceller. Det er imidlertid afgørende, at kriterierne anvendes systematisk på hver enkelt orm, der er kvantificeret. For sædsporing, mange software tilbyder automatisk tracking kapaciteter. Men vi finder, at manuel tracking outudfã ̧rer softwarens automatiske sporings algoritme af to hovedårsager: 1) den overflod af tilsvarende størrelse kerner inden for det lukkede rum gør det vanskeligt for softwaren at skelne mellem individuelle sædceller og oprette definerede ROIs for hver sædcelle. 2) som sperm gå ind og ud af fokus, deres intensiteter Skift, hvilket gør det vanskeligt for softwaren at holde styr på sædcellerne over længere perioder.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi oprigtigt takke vores afdøde mentor, Dr. Michael Miller, for hans inspirerende og uselviske mentorskab og skabelse af denne metode som et værktøj til bedre at forstå sperm og oocyt kommunikation. Hans pludselige død har været et enormt tab for hans familie, hans laboratorium, og det videnskabelige samfund. Denne undersøgelse blev støttet af NIH (R01GM085105 til MAM og F30HD094446 til MH). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra de nationale sundhedsinstitutter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Material | |||
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S671-3 | |
| Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| LB broth, Miller | Fisher | 1426-2 | |
| Escherichia coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | Either this or OP50 E. coli can be used for C. elegans maintenance and assay. Both may be purchased at the CGC |
| N2 | CGC | N2 | |
| fog-2(q71) | CGC | CB4108 | |
| Platinum wire 0.25 mm dia | Alfa Aesar | 10288 | |
| 5 3/4" Disposable Pasteur pipet | Fisher | 13-678-20A | |
| Watch glass | Fisher | 02-612A | |
| 5 mm Dia. Glass rod | Fisher | 50-121-5269 | |
| MitoTracker CMXRos (Mito-dye) | Fisher | M7512 | Shield from light, store at -20 °C |
| Monopostassium phosphate | Fisher | P285-500 | |
| Disodium phosphate | Fisher | S374-1 | |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | BP231-1 | DMSO |
| Aluminum foil | Fisher | 01-213-102 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma | E10521-10G | Tricaine is the common name. Store in aliquotes at -20 °C. |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G | Store in aliquotes at -20 °C |
| Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-A | 18 x 18-1 |
| Frosted microscope slides | Fisher | 12-552-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 16 °C and 20 °C incubators | Fisher | 97-990E | Same model, set at different temperatures. |
| Upright Microscope with epi-fluorescence illuminator, camera, and 10x and 60x objectives | Nikon | ||
| Software with image acquisition and tracking capabilities | Nikon | NIS-elements AR | |
| Stereo-microscope | Nikon | SMZ800N | Any stereo-microscope that can be used to visualize C. elegans may be used with this protocol |
References
- Boryshpolets, S., Perez-Cerezales, S., Eisenbach, M. Behavioral mechanism of human sperm in thermotaxis: a role for hyperactivation. Human Reproduction. 30 (4), 884-892 (2015).
- Edmonds, J. W., McKinney, S. L., Prasain, J. K., Miller, M. A. The gap junctional protein INX-14 functions in oocyte precursors to promote C. elegans sperm guidance. Developmental Biology. 359 (1), 47-58 (2011).
- Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Developmental Cell. 19 (6), 858-871 (2010).
- Espinal-Enriquez, J., Priego-Espinosa, D. A., Darszon, A., Beltran, C., Martinez-Mekler, G. Network model predicts that CatSper is the main Ca(2+) channel in the regulation of sea urchin sperm motility. Scientific Reports. 7 (1), 4236 (2017).
- Hunter, R. H., Nichol, R. A preovulatory temperature gradient between the isthmus and ampulla of pig oviducts during the phase of sperm storage. Journal of Reproduction and Fertility. 77 (2), 599-606 (1986).
- Hussain, Y. H., Guasto, J. S., Zimmer, R. K., Stocker, R., Riffell, J. A. Sperm chemotaxis promotes individual fertilization success in sea urchins. Journal of Experimental Biology. 219 (Pt 10), 1458-1466 (2016).
- Kantsler, V., Dunkel, J., Blayney, M., Goldstein, R. E. Rheotaxis facilitates upstream navigation of mammalian sperm cells. Elife. 3, e02403 (2014).
- Kubagawa, H. M., et al. Oocyte signals derived from polyunsaturated fatty acids control sperm recruitment in vivo. Nature Cell Biology. 8 (10), 1143-1148 (2006).
- Miki, K., Clapham, D. E.
- Ting, J. J., Tsai, C. N., Schalkowski, R., Cutter, A. D. Genetic Contributions to Ectopic Sperm Cell Migration in Caenorhabditis Nematodes. G3. 8 (12), Bethesda. 3891-3902 (2018).
- Yanagimachi, R., et al. Chemical and physical guidance of fish spermatozoa into the egg through the micropyledagger, double dagger. Biology of Reproduction. 96 (4), 780-799 (2017).
- Zhang, Y., et al. Generation of Gradients on a Microfluidic Device: Toward a High-Throughput Investigation of Spermatozoa Chemotaxis. PloS One. 10 (11), e0142555 (2015).
- Hoang, H. D., Miller, M. A. Chemosensory and hyperoxia circuits in C. elegans males influence sperm navigational capacity. PLoS Biology. 15 (6), e2002047 (2017).
- Hansen, J. M., Chavez, D. R., Stanfield, G. M. COMP-1 promotes competitive advantage of nematode sperm. Elife. 4, (2015).
- L'Hernault, S. W.
- Miller, M. A., et al. A sperm cytoskeletal protein that signals oocyte meiotic maturation and ovulation. Science. 291 (5511), 2144-2147 (2001).
- Greenstein, D. Control of oocyte meiotic maturation and fertilization. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-12 (2005).
- O'Hagan, R., Wang, J., Barr, M. M. Mating behavior, male sensory cilia, and polycystins in Caenorhabditis elegans. Seminars in Cell & Developmental Biology. 33, 25-33 (2014).
- Hoang, H. D., Prasain, J. K., Dorand, D., Miller, M. A. A heterogeneous mixture of F-series prostaglandins promotes sperm guidance in the Caenorhabditis elegans reproductive tract. PLoS Genetics. 9 (1), e1003271 (2013).
- McKnight, K., et al. Neurosensory perception of environmental cues modulates sperm motility critical for fertilization. Science. 344 (6185), 754-757 (2014).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).
- Stiernagle, T.
- Chatterjee, I., et al. Dramatic fertility decline in aging C. elegans males is associated with mating execution deficits rather than diminished sperm quality. Experimental Gerontology. 48 (11), 1156-1166 (2013).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. , 80-90 (2017).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Sato, M., Sato, K. Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos. Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).
- Wang, Y., et al. Kinetics and specificity of paternal mitochondrial elimination in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 7, 12569 (2016).
- Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis. Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).
- Mottram, L. F., Forbes, S., Ackley, B. D., Peterson, B. R. Hydrophobic analogues of rhodamine B and rhodamine 101: potent fluorescent probes of mitochondria in living C. elegans. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 8, 2156-2165 (2012).
- Singson, A., Hill, K. L., L'Hernault, S. W. Sperm competition in the absence of fertilization in Caenorhabditis elegans. Genetics. 152 (1), 201-208 (1999).
- Wu, J. C., et al. Sperm development and motility are regulated by PP1 phosphatases in Caenorhabditis elegans. Genetics. 190 (1), 143-157 (2012).
- Seidel, H. S., et al. A novel sperm-delivered toxin causes late-stage embryo lethality and transmission ratio distortion in C. elegans. PLoS Biology. 9 (7), e1001115 (2011).
