تحليل توطين snRNA Spliceosomal في خلايا الهيلا البشرية باستخدام الحقن المجهري
Summary
التكوين الحيوي للsnRNAs snRNAs spliceosomal هي عملية معقدة تنطوي على مختلف المقصورات الخلوية. هنا، وظفنا الحقن الدقيق من snRNAs وصفت الفلورسنت من أجل رصد نقلها داخل الخلية.
Abstract
التكوين الحيوي للsnRNAs snRNAs snrnas هي عملية معقدة تنطوي على كل من المراحل النووية والسيتوبلازمية والخطوة الأخيرة تحدث في مقصورة نووية تسمى هيئة كاجال. ومع ذلك، فإن التسلسلات التي توجه توطين snRNA إلى هذا الهيكل دون النووي لم تكن معروفة حتى وقت قريب. لتحديد تسلسل مهم لتراكم snRNAs في أجسام Cajal، وظفنا الحقن الدقيق من snRNAs وصفت الفلورسنت تليها توطينها داخل الخلايا. أولا، قمنا بإعداد snRNA حذف المسوخ، توليفها قوالب الحمض النووي للنسخ في المختبر وsnRNAs مسجلة في وجود UTP إلى جانب Alexa488. تم خلط snRNAs وصفت مع 70 kDa-Dextran مترافقة مع TRITC، وحقنها بميكروين في النواة أو السيتوبلازم من خلايا HeLa البشرية. تم احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة وثابتة، وكان تصور اللفائف علامة الجسم Cajal من قبل الفلورة المناعية غير المباشرة، في حين snRNAs وdextran، الذي يعمل كعلامة على الحقن النووي أو السيتوبلازم، لوحظ مباشرة باستخدام المجهر الفلورية. يسمح هذا الأسلوب لاختبار فعال وسريع لكيفية تأثير تسلسلات مختلفة على توطين RNA داخل الخلايا. هنا، نبين أهمية تسلسل SM ملزمة لتوطين كفاءة snRNAs في الجسم Cajal.
Introduction
ربط الحمض النووي الريبي هو واحد من الخطوات الحاسمة في التعبير الجيني، الذي يحفزه مجمع ريبونوكليوبروتين كبير يسمى spliceosome. في المجموع، يتم دمج أكثر من 150 بروتين و 5 RNAs النووية الصغيرة (snRNAs) في spliceosome في مراحل مختلفة من مسار الربط. U1، U2، U4، U5 و U6 snRNAs تشارك في الربط من الإنترونات GU-AG الرئيسية. هذه snRNAs الانضمام إلى spliceosome كما شكلت مسبقا جزيئات ريبونوكليوبروتين النووية الصغيرة (snRNPs) التي تحتوي على snRNA, سبعة البروتينات SM المرتبطة snRNA (أو البروتينات مثل SM, التي ترتبط مع SnRNA U6) و 1-12 البروتينات المحددة لكل snRNP.
تجميع snRNPs ينطوي على مراحل السيتوبلازمية والنووية. يتم تصدير snRNA المكتوبة حديثا إلى السيتوبلازم حيث يكتسب حلقة تجميعها من سبعة بروتينات SM. حلقة SM في وقت لاحق بمثابة إشارة لإعادة استيراد snRNA مرة أخرى إلى النواة. يتم الاحتفاظ snRNAs المعيبة التي تفشل في الارتباط مع البروتينات SM في السيتوبلازم1. تظهر الـ snRNPs المستوردة حديثًا لأول مرة في جسم Cajal حيث تلتقي بالبروتينات الخاصة بالsnRNP وتنهي نضجها (تم استعراضها في المرجع2و3). أظهرنا مؤخرا أن تثبيط خطوات النضج النهائي يؤدي إلى عزل snRNPs غير ناضجة في الهيئات Cajal4،5. اقترحنا نموذجا حيث النضج snRNP النهائي هو تحت مراقبة الجودة التي تراقب إضافة البروتينات الخاصة snRNP وتشكيل snRNPs النشطة. ومع ذلك، فإن التفاصيل الجزيئية لكيفية تمييز الخلايا بين الجسيمات الناضجة والشاذة غير الناضجة التي تم تجميعها بشكل صحيح لا تزال بعيدة المنال.
لتحديد تسلسل snRNA التي هي ضرورية لاستهداف وتراكم snRNAs في الهيئات كاجال النووية، قررنا استخدام الحقن الدقيق من snRNAs وصفت الفلورسنت. وكان الحقن المجهري طريقة للاختيار لأنه: 1) أنها لا تتطلب علامة تسلسل إضافية للتمييز snRNAs الاصطناعية تشكل نظرائهم الذاتية وهو أمر مهم بشكل خاص لRNAs قصيرة مع مساحة صغيرة لإدراج تسلسل علامة إضافية; 2) فإنه يسمح بتحليل التسلسلات التي هي مهمة للتكوين الحيوي. على سبيل المثال، تسلسل SM ضروري لتجميع حلقة SM وإعادة الاستيراد إلى النواة6. عندما يتم التعبير عن snRNAs في الخلية ، يتم تدهور snRNAs تفتقر إلى تسلسل SM في السيتوبلازم ولا تصل إلى النواة والهيئات Cajal7. مهما, [سنّن] دون ال [سم] تسلسل يستطيع كنت مباشرة [ميكرونّد] داخل النواة ولذلك دور ممكنة من ال [سم] تسلسل في [كجل] جسم توطين يُسَرَّب.
هنا، ونحن نصف بالتفصيل طريقة الحقن المجهري التي طبقناها لتحديد تسلسل snRNA اللازمة لاستهداف snRNAs في الجسم Cajal5. أظهرنا أن SM وSMN مواقع ملزمة ضرورية وكافية لتوطين ليس فقط snRNAs ولكن مختلف قصيرة غير الترميز RNAs في الجسم Cajal. استنادا ً إلى الحقن المجهري بالإضافة إلى أدلة أخرى، اقترحنا أن حلقة SM تجميعها على موقع الربط SM هو إشارة توطين الجسم Cajal.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد استخدمنا الحقن الدقيق للسنRNAs التي تحمل علامة الفلورسنت لتحديد التسلسلات الهامة لتوطين الرنا في أجسام كاجال النووية. نظرًا لإعداد RNAs المسمى بسرعة وبساطة (إعداد قالب الحمض النووي من قبل PCR متبوعاً بالنسخ في المختبر) تقدم الطريقة تحليلاً فعالاً لكيفية مساهمة التسلسلات المختلفة في توطين…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت هذا العمل مؤسسة العلوم التشيكية (18-10035S)، والبرنامج الوطني للاستدامة الأول (LO1419)، والدعم المؤسسي (RVO68378050)، والصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية (CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) ووكالة المنح التابعة لمنظمة الأمم المتحدة للتنمية الاجتماعية ومنطقة البحر الصناعي. جامعة تشارلز (GAUK 134516). كما نعترف بالمرفق الأساسي للميكروسكوب الخفيف، IMG CAS، براغ، الجمهورية التشيكية (بدعم من المنح (Czech-Bioimaging – LM2015062).
Materials
| ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP | ThermoFisher | C11403 | Stock concentration 1 mM |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics |
| FemtoJet express Injector | Eppendorf | 5247000013 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter |
| Fluoromont G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Stock concentration 5 mg/mL |
| Gridded Glass Coverslips | Ibidi | 10817 | Coverslips with a grid, no direct experience with them |
| InjectMan NI 2 Micromanipulator | Eppendorf | 5181000017 | |
| m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue | Jena Bioscience | NU-853-1 | Stock concentration 40 mM |
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher | AM1354 | |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 | Paul Marienfeld GmbH | 111520 | For routine work |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 | Paul Marienfeld GmbH | 117520 | For high resolution images |
| Microscope DeltaVision | GE Healthcare | For image acquisition | |
| Microscope DMI6000 | Leica | For microinjection | |
| Paraformaldehyde 32% solution EM grade | EMS | 15714 | Dissolved in PIPES to the final concentration 4% |
| Phenol:Chloroform 5:1 | Sigma-Aldrich | P1944 | |
| Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT |
Sigma-Aldrich | T7 rpromoter sequence in italics | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | BioLab | M0530L | |
| RNasin Plus | Promega | N2615 | Stock concentration 40 mM |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa | Sigma-Aldrich | T1162 | Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL |
| Triton-X100 | Serva | 37240 | Dissolved in water, stock concentration 10% |
References
- Ishikawa, H., et al. Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis. Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).
- Stanek, D. Cajal bodies and snRNPs – friends with benefits. RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).
- Stanek, D., Fox, A. H. Nuclear bodies: news insights into structure and function. Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).
- Novotny, I., et al. SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies. Cell Reports. 10, 429-440 (2015).
- Roithova, A., et al. The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation. Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).
- Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap. EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).
- Shukla, S., Parker, R. Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion. Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).
- Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling. Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).
- Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
