Summary

Analyse de la localisation spliceosomale snRNA dans les cellules humaines d'Hela utilisant la microinjection

Published: August 06, 2019
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Summary

La biogenèse des snRNAr spliceosomal est un processus complexe impliquant divers compartiments cellulaires. Ici, nous avons utilisé la microinjection de snRNAs fluorescents afin de surveiller leur transport à l’intérieur de la cellule.

Abstract

La biogenèse des snRNAr spliceosomal est un processus complexe impliquant des phases nucléaires et cytoplasmiques et la dernière étape se produit dans un compartiment nucléaire appelé le corps de Cajal. Cependant, les séquences qui dirigent la localisation de l’ARNs dans cette structure sous-nucléaire n’ont pas été connues jusqu’à récemment. Pour déterminer des séquences importantes pour l’accumulation des snRNAs dans les corps de Cajal, nous avons employé la microinjection des snRNAs fluorescents étiquetés suivis de leur localisation à l’intérieur des cellules. Tout d’abord, nous avons préparé des mutants de suppression de snRNA, synthétisé des modèles d’ADN pour la transcription in vitro et snRNAs transcrits en présence de l’UTP couplé avec Alexa488. Les snARN étiquetés ont été mélangés avec 70 kDa-Dextran conjugués avec TRITC, et microinjectés au noyau ou au cytoplasme des cellules humaines de HeLa. Les cellules ont été incubées pendant 1 h et fixes et la coiline de marqueur de corps de Cajal a été visualisée par immunofluorescence indirecte, alors que les snARN et le dextran, qui sert de marqueur de l’injection nucléaire ou cytoplasmique, ont été observés directement utilisant une microscope fluorescence. Cette méthode permet des tests efficaces et rapides de la façon dont diverses séquences influencent la localisation de l’ARN à l’intérieur des cellules. Ici, nous montrons l’importance de la séquence Sm-contraignante pour une localisation efficace des arnaques dans le corps cajal.

Introduction

L’épissage de l’ARN est l’une des étapes cruciales dans l’expression des gènes, qui est catalysée par un grand complexe de ribonucléoprotéines appelé l’épiscédsome. Au total, plus de 150 protéines et 5 petits ARN nucléaires (ARNN) sont intégrés dans l’épisséoce à différents stades de la voie d’épissage. Les snRNAS U1, U2, U4, U5 et U6 participent à l’épissage des principaux introns GU-AG. Ces snRNAs se joignent à l’épiscédsome comme petites particules de ribonucléoprotéines nucléaires préformées (snRNPs) qui contiennent de l’ARNs, sept protéines Sm associées à l’ARSS (ou protéines Like-Sm, qui s’associent à l’ARNT U6) et 1-12 protéines spécifiques pour chaque snRNP.

L’assemblage des snRNPs implique des étapes cytoplasmiques et nucléaires. L’ARS nouvellement transcrit est exporté vers le cytoplasme où il acquiert un anneau assemblé à partir de sept protéines Sm. L’anneau Sm sert par la suite de signal pour la réimportation de l’ARNds vers le noyau. Les snARN défectueux qui ne s’associent pas aux protéines Sm sont conservés dans le cytoplasme1. Les snRNP nouvellement importés apparaissent pour la première fois dans le corps de Cajal où ils rencontrent des protéines spécifiques au snRNP et terminent leur maturation (revue en référence2,3). Nous avons récemment montré que l’inhibition des étapes finales de maturation entraîne la séquestration des snRNPs immatures dans les corps de Cajal4,5. Nous avons proposé un modèle où la maturation finale de snRNP est sous contrôle de qualité qui surveille l’addition des protéines snRNP-spécifiques et la formation des snRNPs actifs. Cependant, les détails moléculaires de la façon dont les cellules font la distinction entre les particules matures et immatures aberrantes correctement assemblées restent insaisissables.

Pour déterminer les séquences d’ARNs qui sont essentielles pour le ciblage et l’accumulation des ARNs dans les corps nucléaires de Cajal, nous avons décidé d’utiliser la microinjection de snRNAs fluorescents. La microinjection était une méthode de choix parce que : 1) il ne faut pas une étiquette de séquence supplémentaire pour distinguer les snRNAs synthétiques forment leurs homologues endogènes qui est particulièrement important pour les ARN courts avec peu d’espace pour l’insertion de séquence supplémentaire d’étiquette ; 2) il permet l’analyse des séquences qui sont importantes pour la biogenèse. Par exemple, la séquence Sm est essentielle pour l’assemblage de l’anneau Sm et la réimportation dans le noyau6. Lorsque les snRNAS sont exprimés dans la cellule, les snRNAs dépourvus de la séquence Sm sont dégradés dans le cytoplasme et n’atteignent pas le noyau et les corps cajal7. Cependant, les snRNAs sans la séquence Sm peuvent être directement microinjectés dans le noyau et donc un rôle potentiel de la séquence Sm dans la localisation du corps Cajal a été mis en compte.

Ici, nous décrivons en détail une méthode de microinjection que nous avons appliquée pour déterminer les séquences snRNA nécessaires pour cibler les ARNs dans le corps cajal5. Nous avons montré que les sites de liaison Sm et SMN sont ensemble nécessaires et suffisants pour localiser non seulement les ARN, mais aussi divers ARN courts non codants dans le corps de Cajal. Sur la base de la microinjection ainsi que d’autres preuves, nous avons proposé que l’anneau Sm assemblé sur le site de liaison Sm est le signal de localisation du corps Cajal.

Protocol

1. Préparation des snARN pour la microinjection Préparer un modèle d’ADN contenant la version intégrale ou tronquée/mutée de l’ARNs par PCR à l’aide d’une configuration PCR suivante : 98 oC pour 60 s, 98 oC pour 15 s, 68 oC pour 30 s, 72 oC pour 1 min, 98 oC pour 15 s pour 35x , et 72 oC pendant 5 min. L’apprêt avant doit contenir une séquence de promoteur pour la transcription in vitro juste en amont du premier nucléotide transcrit. Amplifiez la séquence snRNA de U2 à l’aide de l’amorce a…

Representative Results

Pour surveiller la localisation de snRNA et le rôle du site de liaison de Sm dans le ciblage de corps de Cajal, nous avons préparé un modèle d’ADN contenant le promoteur de T7 et l’ARNs de S2 pleine longueur ou le snRNA de U2 manquant les sept nucléotides (AUUUUUG) formant le site de liaison de Sm. les snRNAs ont été transcrits in vitro, isolés et mélangés avec le dextran-70kDa TRITC-coupled. Nous avons microinjecté le mélange contenant l’ARNs transcrit in vitro dans le noyau ou le cytoplasme des cellules de …

Discussion

Nous avons employé la microinjection des snRNAs fluorescents pour déterminer des séquences importantes pour la localisation de snRNA dans les corps nucléaires de Cajal. En raison de la préparation rapide et assez simple des ARN étiquetés (préparation du modèle d’ADN par PCR suivi de la transcription in vitro), la méthode offre une analyse efficace de la façon dont les différentes séquences contribuent à la localisation de l’ARN. En relativement peu de temps, nous avons pu analyser dix suppressions ou substi…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la Fondation tchèque pour la science (18-10035S), le Programme national de développement durable I (LO1419), le soutien institutionnel (RVO68378050), le Fonds européen de développement régional (CZ.02.1.01/0.0/0.0/16-013/0001775) et l’Agence de subventions de Université Charles (GAUK 134516). Nous reconnaissons en outre le Centre de microscopie légère, IMG CAS, Prague, République tchèque (soutenu par des subventions (Czech-Bioimaging – LM2015062).

Materials

ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP ThermoFisher C11403 Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium – high glucose Sigma-Aldrich D5796 Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector Eppendorf 5247000013
Femtotips II Eppendorf 930000043 Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI SouthernBiotech 0100-20
Glycogen ThermoFisher AM9510 Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips Ibidi 10817 Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator Eppendorf 5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue Jena Bioscience NU-853-1 Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit ThermoFisher AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 Paul Marienfeld GmbH 111520 For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 Paul Marienfeld GmbH 117520 For high resolution images
Microscope DeltaVision GE Healthcare For image acquisition
Microscope DMI6000 Leica For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade EMS 15714 Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1 Sigma-Aldrich P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG,
Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT
Sigma-Aldrich T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase BioLab M0530L
RNasin Plus Promega N2615 Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa Sigma-Aldrich T1162 Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100 Serva 37240 Dissolved in water, stock concentration 10%

References

  1. Ishikawa, H., et al. Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis. Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).
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  3. Stanek, D., Fox, A. H. Nuclear bodies: news insights into structure and function. Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).
  4. Novotny, I., et al. SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies. Cell Reports. 10, 429-440 (2015).
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Citer Cet Article
Roithová, A., Staněk, D. Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection. J. Vis. Exp. (150), e59797, doi:10.3791/59797 (2019).

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