Analyse van Spliceosomale snRNA lokalisatie in menselijke HeLa cellen met behulp van micro Injection
Summary
Biogenese van spliceosomal snRNAs is een complex proces waarbij verschillende cellulaire compartimenten. Hier hebben we een micro injectie met fluorescently gelabelde Snrna’s gebruikt om hun transport in de cel te bewaken.
Abstract
Biogenese van spliceosomale Snrna’s is een complex proces waarbij zowel nucleaire als cytoplasmatische fasen en de laatste stap optreedt in een nucleair compartiment genaamd de Cajal lichaam. Echter, sequenties die direct snRNA lokalisatie in deze subnucleaire structuur zijn niet bekend tot voor kort. Om de sequenties te bepalen die belangrijk zijn voor accumulatie van Snrna’s in Cajal-lichamen, werkten we met micro injectie van fluorescently gelabelde Snrna’s, gevolgd door hun lokalisatie in cellen. Eerst bereidden we snRNA deletie mutanten voor, synthetiseerde DNA templates voor in vitro transcriptie en transcribeerde Snrna’s in aanwezigheid van UTP in combinatie met Alexa488. Gelabelde Snrna’s werden gemengd met 70 kDa-dextran geconjugeerd met TRITC, en microgeïnjecteerde naar de Nucleus of het cytoplasma van menselijke HeLa cellen. Cellen werden gedurende 1 uur geïnincubeerd en de Cajal-Body marker coilin werd gevisualiseerd door indirecte immunofluorescentie, terwijl Snrna’s en dextran, die dient als een marker van nucleaire of cytoplasmatische injectie, direct werden waargenomen met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Deze methode maakt het mogelijk om efficiënt en snel te testen hoe verschillende sequenties de RNA lokalisatie in cellen beïnvloeden. Hier tonen we het belang van de SM-bindende sequentie voor efficiënte lokalisatie van Snrna’s in de Cajal-body.
Introduction
RNA splicing is een van de cruciale stappen in genexpressie, die wordt gekatalyseerd door een groot RiboNucleoProteïne complex genaamd de spliceosome. In totaal zijn meer dan 150 eiwitten en 5 kleine nucleaire rna’s (snrna’s) geïntegreerd in de spliceosoom in verschillende stadia van het splicing traject. De Snrna’s U1, U2, U4, U5 en U6 nemen deel aan de splitsing van de grote GU-AG introns. Deze snrna’s voegen zich bij de spliceosoom als voorgevormde kleine nucleaire RiboNucleoProteïne deeltjes (snrnps) die snrna bevatten, zeven SM-eiwitten geassocieerd met snrna (of like-SM-eiwitten, die associëren met de U6 snrna) en 1-12 eiwitten die specifiek zijn voor elke snRNP.
Assemblage van snRNPs omvat cytoplasmatische en nucleaire stadia. Nieuw getranscribeerd snRNA wordt geëxporteerd naar het cytoplasma waar het verwerft een ring geassembleerd uit zeven SM-eiwitten. De SM-ring dient vervolgens als een signaal voor het opnieuw importeren van snRNA terug naar de Nucleus. Defecte Snrna’s die niet associëren met SM eiwitten worden bewaard in het cytoplasma1. Nieuw geïmporteerde snrnps verschijnen eerst in het lichaam van Cajal waar ze snRNP-specifieke eiwitten ontmoeten en hun rijping voltooien (beoordeeld in referentie2,3). We hebben onlangs aangetoond dat remming van de uiteindelijke rijpings stappen resulteert in vastlegging van onrijpe snrnps in Cajal-lichamen4,5. We stelden een model voor waarbij de uiteindelijke rijping van snRNP onder kwaliteitscontrole is die de toevoeging van snRNP-specifieke eiwitten en de vorming van actieve snRNPs bewaakt. Echter, moleculaire Details van hoe cellen onderscheid maken tussen correct geassembleerde volwassen en afwijkende onvolgroeide deeltjes blijven ongrijpbaar.
Om snRNA-sequenties te bepalen die essentieel zijn voor de targeting en accumulatie van Snrna’s in nucleaire Cajal-lichamen, hebben we besloten om micro injectie van fluorescently gelabelde Snrna’s in gebruik te nemen. Micro Injection was een methode van keuze omdat: 1) het vereist geen extra sequentie tag om synthetische Snrna’s te onderscheiden van hun endogene tegenhangers, wat vooral belangrijk is voor korte Rna’s met weinig ruimte voor het inbrengen van extra tagvolgorde; 2) het maakt analyse van sequenties die belangrijk zijn voor biogenese. De SM-reeks is bijvoorbeeld essentieel voor SM-ring assemblage en opnieuw importeren in de Nucleus6. Wanneer Snrna’s worden uitgedrukt in de cel, Snrna’s ontbreekt de SM sequentie zijn afgebroken in het cytoplasma en niet bereiken de Nucleus en Cajal lichamen7. Echter, Snrna’s zonder de SM sequentie kunnen direct microgeïnjecteerd in de Nucleus en dus een mogelijke rol van de SM sequentie in Cajal lichaam lokalisatie geassageerd.
Hier beschrijven we in detail een micro injectie methode die we hebben toegepast om snRNA-sequenties te bepalen die nodig zijn om Snrna’s in de Cajal-Body5te targeten. We toonden aan dat SM en SMN binding sites samen noodzakelijk en voldoende zijn om niet alleen Snrna’s te lokaliseren, maar verschillende korte niet-Codeer Rna’s in het Cajal lichaam. Op basis van Microinjection en ander bewijs, stelden we voor dat de SM-ring die op de SM-bindingsplaats is geassembleerd, het Cajal-lichaam lokalisatie signaal is.
Protocol
Representative Results
Discussion
We werkten met Microinjection van fluorescently gelabelde Snrna’s om sequenties te bepalen die belangrijk zijn voor snRNA-lokalisatie in nucleaire Cajal-lichamen. Door een snelle en vrij eenvoudige bereiding van gelabelde Rna’s (voorbereiding van DNA-Template door PCR gevolgd door in vitro transcriptie) biedt de methode een effectieve analyse van hoe verschillende sequenties bijdragen aan RNA lokalisatie. In relatief korte tijd konden we tien verschillende verwijderingen of vervangingen van het snRNA van U2 (referentie<s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Tsjechische wetenschaps Stichting (18-10035S), het nationaal duurzaamheidsprogramma I (LO1419), institutionele ondersteuning (RVO68378050), het Europees Fonds voor regionale ontwikkeling (CZ. 02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) en het subsidie Bureau van Universiteit van Charles (GAUK 134516). Verder erkennen we de Lichtmicroscopie kern faciliteit, IMG CAS, Praag, Tsjechië (ondersteund door subsidies (Tsjechisch-Bioimaging-LM2015062).
Materials
| ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP | ThermoFisher | C11403 | Stock concentration 1 mM |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics |
| FemtoJet express Injector | Eppendorf | 5247000013 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter |
| Fluoromont G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Stock concentration 5 mg/mL |
| Gridded Glass Coverslips | Ibidi | 10817 | Coverslips with a grid, no direct experience with them |
| InjectMan NI 2 Micromanipulator | Eppendorf | 5181000017 | |
| m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue | Jena Bioscience | NU-853-1 | Stock concentration 40 mM |
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher | AM1354 | |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 | Paul Marienfeld GmbH | 111520 | For routine work |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 | Paul Marienfeld GmbH | 117520 | For high resolution images |
| Microscope DeltaVision | GE Healthcare | For image acquisition | |
| Microscope DMI6000 | Leica | For microinjection | |
| Paraformaldehyde 32% solution EM grade | EMS | 15714 | Dissolved in PIPES to the final concentration 4% |
| Phenol:Chloroform 5:1 | Sigma-Aldrich | P1944 | |
| Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT |
Sigma-Aldrich | T7 rpromoter sequence in italics | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | BioLab | M0530L | |
| RNasin Plus | Promega | N2615 | Stock concentration 40 mM |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa | Sigma-Aldrich | T1162 | Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL |
| Triton-X100 | Serva | 37240 | Dissolved in water, stock concentration 10% |
References
- Ishikawa, H., et al. Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis. Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).
- Stanek, D. Cajal bodies and snRNPs – friends with benefits. RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).
- Stanek, D., Fox, A. H. Nuclear bodies: news insights into structure and function. Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).
- Novotny, I., et al. SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies. Cell Reports. 10, 429-440 (2015).
- Roithova, A., et al. The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation. Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).
- Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap. EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).
- Shukla, S., Parker, R. Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion. Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).
- Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling. Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).
- Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
