Summary
ここに提示されるペプチドベースの小さなユニラメラ小胞の作成のためのプロトコルは、成長することができる。膜ペプチドのベシキュロ産生を容易にするために、これらの小胞は転写翻訳システムおよびペプチドコードプラスミドが装備されている。
Abstract
生化学反応の区分化は、合成細胞の中心的な側面である。この目的のために、ペプチドベースの反応コンパートメントは、リポソームまたは脂肪酸ベースの小胞に対する魅力的な代替手段として機能する。外部または小胞内では、ペプチドを容易に発現し、膜前駆体の合成を簡素化することができる。ここで提供されるのは、ガラスビーズからの脱水水分補給を利用した両生血球エラスチン様ポリペプチド(ELP)に基づいて、直径約200nmの小胞を作成するためのプロトコルである。また、逆温度サイクリングによる細菌ELP発現および精製のためのプロトコル、ならびに蛍光色素によるその共生機能化についても提示する。さらに、本報告では、生化学反応の非複雑な例として、ELP小胞内のRNAアプタマーdBroccoliの転写を可能にするプロトコルについて説明する。最後に、蛍光タンパク質および膜ペプチドのベシキュロ発現を可能にするプロトコルが提供され、後者の合成は小胞の増殖をもたらす。
Introduction
合成生細胞系の作成は、通常、2つの異なる方向からアプローチされます。トップダウン法では、細菌のゲノムは必須成分に還元され、最終的には最小限の細胞につながります。ボトムアップアプローチでは、人工細胞は分子成分または細胞サブシステムからde novoを組み立てられ、一貫した細胞様システムに機能的に統合される必要があります。
de novoアプローチでは、必要な生化学成分の区分化は、通常、リン脂質または脂肪酸1、2、3、4から作られた膜を使用して達成される。これは、「現代」細胞膜は主にリン脂質から成り、脂肪酸はプレバイオティクス膜エンクロージャ5、6のもっともらしい候補と考えられているからである。新しい膜の形成、または膜の成長を促進するために、両友病のビルディングブロックは、対応する同化プロセス4を使用して膜区画内の生産を通じて、外側7から、または理想的には提供されなければならない。 、8.
脂質合成は比較的複雑な代謝過程であるが、ペプチドは無細胞遺伝子発現反応9、10を用いて非常に容易に産生することができる。したがって、親質ペプチドによって形成されたペプチド膜は、11を成長させることができる人工細胞模倣のためのエンクロージャとして脂質膜に対する興味深い代替手段を表す。
親水性エラスチン様二重合体(ELP)は、このような膜12のビルディングブロックとして機能することができるペプチドの魅力的なクラスである。ELPの基本アミノ酸配列モチーフは(GaGVP)nであり、「a」はプロリンを除く任意のアミノ酸であり、「n」は繰り返されるモチーフの数13、14、15、16、17である。.ELPは、主にフェニルアラニンを含む疎水性ブロックと、グルタミン酸11からなる親水性ブロックを用いて作成されている。pHおよび塩濃度などの溶液パラメータに応じて、ELPは温度Ttでいわゆる逆温度遷移を示し、ペプチドは親水性から疎水性への完全に可逆的な相転移を受ける状態。ペプチドの合成は、細菌細胞抽出物「TX-TL」を用いて小胞内で容易に実施することができる。結合転写および翻訳反応に必要なすべてのコンポーネント。
TX-TLシステムは、ガラスビーズからの脱水水分補給を固体サポートとして利用してELP小胞にELPをコードするDNAテンプレートを併用して一緒にカプセル化しました。小胞の形成は、ビーズ表面11からの乾燥ペプチドの水分補給を通じて起こる。小胞形成のための他の方法22は、潜在的に低い多分散性およびより大きな小胞サイズ(例えば、電気形成、エマルジョン相移動、またはマイクロ流体ベースの方法)を示す。封入法の生存率を試験するために、フッ素性アプタマーdBroccoli23の転写を代わりに11を用いることができ、これはTX-TL系を用いた遺伝子発現よりも複雑ではない。
ベシキュロにおける膜ビルディングブロックの発現とその後の膜への組み込みにより、小胞は11に成長し始める。ELPの膜組み込みは、FRETアッセイを介して実証することができる。この目的のために、初期小胞集団の形成に使用されるELPは、FRET対を構成する等しい分株で蛍光色素と結合される。ベシキュロにおける非標識ELPの発現および膜への組み込み時に、膜内の標識されたELPが希釈され、その結果、FRET信号は11減少する。共役のための汎用性と一般的な方法として、銅触媒アジドアルキネシクロ添加が使用される。トリス(ベンジルトリアゾリルメチル)-アミンなどの安定化リガンドを使用すると、反応は、共振反応に適した反応剤11の加水分解なしで生理学的pHで水溶液中で行うことができる。ペプチドを含む。
以下のプロトコルは、ELPベースのペプチドソームを成長するための製剤の詳細な説明を提示する。ガラスビーズ法を用いたペプチドおよび小胞形成の発現について説明する。さらに、ELP小胞内のタンパク質発現に対するフッ素性dBroccoliアプタマーおよび転写転写転写反応の転写を実施する方法について説明する。最後に、提供されるのは、蛍風素を有するELPの結合のための手順であり、これはFRETアッセイ11を介して小胞の成長を証明するために使用することができる。
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Protocol
1. エラスチン様ポリペプチドの発現
- 1日目:ペプチド発現のためのスターター培養と供給の準備
- LB培地のフラスコ(4 x 2.5L)及び3LのLB培養フラスコを調修及びオートクレーブ。LB培地の1Lの場合は、1Lの超純水に25gのLB粉末を加えます。
- LB培地の100 mL、無菌濾過(0.22μmフィルター)クロラムフェニコール溶液(EtOHでは25mg/mL)、50μLの滅菌フィルター(0.22μmフィルター)カルベニシリン溶液(50%EtOHおよび50%のEtOHおよび50%の水)でスターター培養を行います。
- ポリペプチド配列MGHGVGVP((GEGVP) 4(GVGVP)4(GFGVP)4(GFGVP)4(GVGVP)3を含む大腸菌株BL21(DE3)pLysSを含む予備の細菌ストックから小さな筋を追加します。(GFGVP)4GWP(EFと略記)を予め温めた100 mLスターター培養物にし、振盪インキュベーターで250rpmで16時間37°Cでインキュベートする(大腸菌株およびベクターは要求あり)。
- 発現培養フラスコとLB培養を一晩37°Cで予め温め、翌日に備える。
- 2日目:タンパク質発現
- 各発現培養フラスコにLB培地の750mL、無菌濾過(0.22μmフィルター)クロラムフェニコールストック(EtOHでは25mg/mL)、無菌フィルター(0.22μmフィルター)カルベニシリンストック(100mg/mL)の375μLを50%、50%の水当性を添加する。
- 抗生物質を分配するために攪拌した後、600nm(OD 600)での光学密度測定のための基準サンプルとして培媒の2mLを取る。
- 発現フラスコに開始培養の7.5 mLを追加し、250rpmで37°Cで1時間インキュベートします。
- このステップの後、各フラスコのOD600は20分ごとにチェックされます。
- 光学密度が約0.8°Cに達すると、温度を16°Cに下げ、1M無菌濾過β-イソプロピルチオガラクシド(IPTG)の750μLを各発現フラスコに超純水に添加してペプチド発現を誘導する。
- 誘導細菌で発現フラスコを16°Cで250rpmで16°Cでインキュベートする。
- 3日目:発現ポリペプチドの抽出
- 収穫後の細胞ペレットの質量の決定を可能にするために遠心フラスコを予計する。
- 4,000 x gおよび4°Cで予冷した遠心分離機を用いて20分間遠心分離によって発現フラスコからすべての細菌を収穫する。
- 上清を注ぎ、無菌のペーパータオルに遠心ボトルをブロットします。
- 遠心フラスコの重量を量り、セルペレット質量を計算します。
- 元の細胞培養物の750 mLからペレットダウンした細胞を、ピペッティングによりリン酸緩衝生理食べ物(PBS、pH 7.4)の15mLで、遠心分離機を4°Cで20分間4,000xgで再中断する。上清を注ぎ、無菌のペーパータオルに遠心ボトルをブロットします。
- リゾザイム(1mg/mL)、1mMフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)、1mMベンザミジン、および0.5UのDNase Iを用いて、PBS(pH 7.4)を用いた細胞ペレット1グラム当たり2mLの緩衝液ステップに対する細胞ペレットを再ステージングする。
- 10s超音波処理と20sの一時停止ステップを交互に8 Wで8 Wで氷上でさらなるライシスのために細胞を超音波処理し、その後、サンプルが氷上で冷却されるべき9分間の休止が続きます。もう一度9分の超音波処理ステップを繰り返します。
- 核酸沈殿のための元の細胞培養の1L当たり10%(w/v)ポリエチレンアイミン(PEI)の2mLを添加する。
- サンプルを2mL遠心チューブに分配し、60°Cで10分間インキュベートし、その後4°Cで10分間インキュベーションを行います。
- 溶液を4°Cで10分間16,000xgで遠心分離し、ELPを含む上清を回収する。
- 逆温度サイクリングによるタンパク質精製:
- 上清を2のpHに調整し、ペプチドの親水性部分を疎水性に切り替え、凝集を誘導する。pHを調整するために、リン酸と水酸化ナトリウムが使用される。pHストライプは、pHレベルを決定するのに十分です。
- 試料の精製の収率を向上させるには、試料を60°Cに加熱し、塩化ナトリウムを2Mまで添加する。
- 続いて、室温(RT)で10分間16,000xgで試料を遠心分離する。
- 上清を破棄し、PBSでペレットを再溶解します(ただし、前のステップと比較して初期体積の半分しか使用されています)。
- リン酸と水酸化ナトリウムでpHを7に調整します。pHストライプは、pHを決定するのに十分に正確です。
- その後、サンプルを16,000 x gで4°Cで10分間遠心分離します。
- 上清を収集し、ステップ1.4.4の最後の繰り返しでは、PBSの代わりに水のみが追加される場合を除き、合計1.4.1~1.4.6を合計3倍まで繰り返します。
- 吸収分光計でペプチドの濃度を測定します。280 nm で 5500/M/cm の消滅係数を使用します。
- ELPの濃度を700 μMに調整します。
2. ガラスビーズ法を用いたベシクル製造
- 遠心真空濃縮器を使用してELP溶液を1.1mMに濃縮します。
- 濃縮ELP溶液の200 μLを2:1クロロホルム/メタノール混合物の1,250 μLと混合し、その後に渦を混ぜます。
- 球状ガラスビーズ(サイズ212~300μm)を10mLの丸底フラスコに1.5g加えます。
- ELPとクロロホルム/メタノール混合物を含む溶液を丸底フラスコに加え、穏やかな振盪で混ぜます。
- フラスコをロータリーエバポレータに接続します。速度を 150 rpm に調整し、液体が室温で蒸発するまで約 4 分間-0.2 x 105 Pa (-200 mbar) に圧力を調整します。
- 丸い底のフラスコを少なくとも1時間デシケータに入れ、残りのクロロホルムとメタノールが蒸発することを確認します。ガラスビーズの損失を避けるために、緩く取り付けられたアルミ箔は、丸い底のフラスコ開口部の周りにラップする必要があります。
- 単一の実験では、ペプチド覆われたガラスビーズの100mgをPBSなどの膨潤溶液の60 μLと混合する。このサンプルを25°Cで5分間インキュベートします。
- ガラスビーズを堆積させるために、テーブルトップ遠心分離機でサンプルを素早く遠心分離します。
- 小胞を含む上清を収集するためにピペットを使用してください。
3. 大胞内のRNAアプタマーdBroccoliの転写
- RNaseの除染液を含むワイプでラボベンチを清掃し、RNaseフリーの作業環境を作成します。
- T7プロモーターとdブロッコリー配列を含むssDNA(5μM)を混合する(GAGACGCGCGGGTCCCTGAGACGGGGTCGGGTCCATTCTTCTTGTGTGTGGTGGTGGTGGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTGGTGGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCGCGCTTC)を含む、核不全水水で満たします。RNAPol反応バッファー[40 mMトリス-HCl(pH=7.9)、6 mMMgCl 2、1 mMジチオスレイトール(DTT)、および2mMスペルミジン)、転写反応のためのDNAテンプレートを調製する。
- 溶液を90°Cで5分間インキュベートし、その後30分間20°Cまでゆっくりと温度を下げます。
- 1 mM(5Z)-5-(3,5-ジフルオロ-4-ヒドロキシベンジリデン)-2,3-ジメチル-3,5-ジヒドロ-4H-イミダゾール-4-1(DFHBI)溶液をDMSOの5mLで1.26mgのDFHBIを溶解することにした。
- RNAPol反応バッファー[40 mMトリス-HCl(pH=7.9)、6mM MgCl 2、1mMジチオスレイトール(DTT)、および2mMスペルミジンを125mM KClと混合して転写反応を調製する。 15 mM MgCl2,4 mM rNTP, 10 μM DFHBI, 200 nM DNA テンプレート, 0.5 U/μL RNase抑制剤のマウス、および水。
- 反応が始まる直前に、4 U/μL T7ポリメラーゼを加えます。
- この反応ミックスをステップ2.7の膨潤液として使用し、実験期間中37°Cでインキュベートし、通常は1時間である。
4. 転写翻訳(TX-TL)反応
注:転写翻訳反応には、反応バッファーおよびDNAと同様に粗細胞抽出物が必要である。粗細胞抽出物は、Sun et al.18に記載されているように調製される。TX-TL反応の場合は、粗大腸菌抽出物の33%(v/v)、42%(v/v)反応バッファー、25%(v/v)フェノールクロロホルム精製DNAプラス添加剤を使用します。最終濃度は約9mg/mLタンパク質、50mM HEPES(pH=8)、1.5mM ATP、1.5mM GTP、0.9mM CTP、0.9mM UTP、0.2 mg/mL tRNA、26mMコエンザイムA、0.33mM NADM、0.75mM,30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000, 13.3 mM マルトース, T7 RNA ポリメラーゼの 1 U, および 50 nM プラスミド DNA を超純水中.
-
DNAテンプレートのフェノールクロロホルム精製
- LB培地5mL、無菌濾過(0.22μmフィルター)カルベニシリン溶液(50%EtOHで100mg/mL、50%超純水)で6つの一晩培養を行います。
- pET20b(+)発現ベクターを含むDH5α大腸菌を含むあらかじめ作られた細菌ストックから小さなストリークを各予め温めた5 mLの一晩培養に加え、250rpmで16時間37°Cでインキュベートします。どのペプチド(EF)またはタンパク質(YPetまたはmVenus)が発現されるかに応じて、特異的なエンコードプラスミドが使用される。
- ユーザーマニュアルに記載されているミニプレップキットでプラスミドを抽出するか、Zhang et al.24によって提供されるプロトコルに従います。
- 精製前プラスミドDNAの100 μL(濃度は200~600ng/μLの範囲)を調製し、微小遠心管内のロチフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールの100μL(pH =7.5~8.0)と混合して、より良い相分離を可能にします。
- RTでチューブを6倍までゆっくりと反転させ、遠心分離機をRTで16,000 x gで5分間反転させます。
- チューブの上相に200μLのクロロホルムを追加し、チューブを6倍まで反転させます。
- RTで5分間16,000 x gでサンプルを遠心分離します。
- 上清を別のチューブにピプテし、エタノール沈殿用に酢酸ナトリウムの10 μLを加えます。
- -80 °Cコールドエタノールの1 mLを追加し、1時間-80°Cでサンプルを保存します。
- 4°Cで15分間16,000 x gでサンプルを遠心分離します。
- 上清をデカントし、-20 °Cコールド70%(v/v)エタノールの1 mLを追加します。
- 4 °Cで5分間16,000 x gの遠心分離機。
- ピペッティングで液体を取り除きます。DNAペレットの邪魔にならないように注意してください。
- 残りのエタノールを蒸発させるために約15分間RTでサンプルを保存します。
- サンプルに超純水を加え、サンプル濃度を約300nMに調整し、260nmで吸収して測定します。
-
TX-TL反応の調製
- 調製した粗細胞抽出物と氷上の反応バッファーを解凍する。
- 60 μL反応ミックスの場合、プラスミドDNA(フェノールクロロホルム精製)を反応バッファーの37.5 μLに加え[50 mM HEPES(pH=8)]、1.5mM ATP、1.5mM GTP、0.9mM CTP、0.9 mM UTP、0.2 mM/ML tRNA、m3,0.75 mM cAMP, 68 mM フォリン酸, 1 mM スペルミジン, 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000, および 13.3 mM マルトース), 続いて粗細胞抽出物の 28.7 μL を添加.58.8 μLに超純水で最終容積に充填します。
- 反応が始まる直前に、T7 RNAポリメラーゼ溶液の1.2 μLを加え、上下にピペッティングしてサンプルを混合します。
- この反応ミックスをステップ2.7の腫脹溶液として使用し、実験の持続時間(通常は4〜8時間)の29°Cでインキュベートする。
5. 銅触媒アジドアルキネ・ホイスゲン・サイクロ添加によるフラオロフォアとのエラスチン様ポリペプチドの結合
- DMSOに20mM NHS-アジドブチル酸N-ヒドロキシスチニミドエステル溶液を調製する。
- PBS(8 g/L NaCl、0.2 g/L KCl、1.42 g/L Na2HPO 4、0.27 g/L K2HPO4、pH= 7.2)およびNHS-アジド(1.2 mM)と12hでインキュベートするELP溶液(600 μM)を混合し、12 hでインキュベートします。
- 10 kDa透析カセットにサンプルをロードし、塩と残留NHS-azideを除去するために、超純水の1Lで12時間4°Cで保存します。
- 活性ELP(500 μM)をアルキン結合色素(500μM)、Cy5-アルキン、またはCy3-アルキンと混合します。
- このサンプルを1mM TBTA(トリス(ベンジルトリアゾリルメチル)アミン)、10mM TCEP(トリス(2-カルボキシエチル)-塩酸リン)と10mM CuSO4と混合し、12時間4°Cでインキュベートします。
- 10 kDa透析カセットにサンプルをロードし、1Lの超純水で12時間4°Cに保存し、塩と残留アルキン結合染料を除去します。
- これらの色素修飾ELPは、Cy3標識ELPとCy5標識ELPの1:1混合物で使用され、第2部のペプチドに類似したElPを標識する。
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Representative Results
ベシクル生産
図1は、異なる膨潤溶液およびガラスビーズ法で調製された小胞の透過電子顕微鏡(TEM)画像を示す(Vogele etal.11も参照)。図1Aの試料については、小胞の形成を証明し、その大きさを決定するために、腫脹溶液としてPBSのみを使用した。TX-TLを膨潤液(図1B)として用いた場合、小胞も形成した。動的光散乱(DLS)測定は、ガラスビーズ法が小胞形成に影響を及ぼすことを示すために行われた。図2は、PBS(青色)にガラスビーズを含まずに調製したEF試料の測定強度自己相関曲線と、膨潤液(赤色)としてPBSを用いたガラスビーズ法で調製したEF試料を示す。サイズは、クミュラントフィット25から計算され、ガラスビーズ法なしで小胞を調製した場合、25%の多分散性を持つ直径134nmをもたらした。ガラスビーズを使用した場合、クミュランフィットは直径168nm、多分散性は21%であった。
ベシキュロ転写中 11歳
図3は、EF小胞内のdBroccoliアプタマーの転写に対する時間の経過に伴う蛍光強度プロファイル(緑色)を示す。陰性対照として、DNase Iを腫脹溶液に添加し、したがって小胞形成時にも組み込まれた(青色)。測定は、480nmで励起し、520nmで発光した蛍光プレートリーダーで行った。
ベシキュロタンパク質発現中 11歳
図4は、蛍光プレートリーダーを用いてELP小胞内で発現した2つの蛍光タンパク質の蛍光強度を示す。励起は520nmで500nm及び発光を行った。mVenus(図4A)の転写翻訳は、ELP小胞におけるタンパク質の発現ダイナミクスおよび発現レベルを調べるために行った。小胞形成後、小胞と外溶液の内容は同じことに注意することが重要です。従って、小胞の外側のタンパク質発現を抑制するために、抗生物質カナマイシンを外部溶液に添加した。対照として、カナマイシンも腫脹溶液に添加し、その場合、小胞内のタンパク質発現が抑制された。これはさらに、小さな分子カナマイシンが小胞の中にとどまることを示唆し、これらの実験の時間スケールにわたってこの分子に対して膜が透過性でないことを示唆している。カナマイシンが膜を通して拡散した場合、mVenus発現は抑制されず、5時間で蛍光が高くなります。第2の実験では、YPet(図4B)の発現を行った。両方のタンパク質は、例えばGFPよりも早い成熟時間を示すので選ばれました。さらに、T7プロモーターは、mVenus転写およびYPet転写に用いられる構成的プロモーターに使用され、誘導性および連続発現の両方が可能であることを示した。
フレットアッセイ 11歳
図5Aは、膜へのELP取り込みを実証するために行われたFRETアッセイの結果を示す。従って、小胞は、2つの等しく濃縮されたフルオロフォアペプチド構造体の混合物を用いて製造された。これらは、Cy3-EF(ドナー)およびCy5-EF(受諾器)であった。時間t=0では、開始FRETレベルを測定した。ドナーとFRET信号の信号は、膜内の染料間の平均距離に依存します。膜ELPの発現時に、追加のペプチドが膜に組み込み、FRET対間の平均距離が増加する。後者は、ドナー蛍光の増加および時間t=2.5h.図5BにおけるFRETシグナルの減少を通じて測定され、陰性対照を示す。ここで、カナマイシンを小胞形成前の膨潤液に添加した。カナマイシンはタンパク質発現を抑制します。したがって、FRET の変化は見えませんでした。このアッセイは EF の組み込みのみを示している点に注意することが重要です。
図 1:代表的なTEM画像。(A)膨潤溶液PBSに形成されたEF小胞。(B)膨潤溶液TX-TLに形成されたEF小胞。スケール バー = 200 nm。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:代表的な DLS データ。DLSによって測定された強度自己相関曲線。青い曲線は、ガラスビーズ法を用かずに調製されたPBS中のEFペプチドを描写する。赤い曲線は、ガラスビーズ法とPBSを膨潤溶液として製造したEF溶液を示しています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3:dブロッコリー転写。EF小胞内のdBroccoliアプタマーの転写の代表的なデータ。緑色の曲線は蛍光信号を示し、青い曲線はカプセル化されたDNase I.でコントロール測定を示し、この図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。
図4:ペプチド小胞内のタンパク質発現(A) mVenusおよびTX-TL発現ミックスをコードするプラスミドをELP小胞に封入した。約5時間後、蛍光が飽和した。抗生物質カナマイシンも封入された場合、蛍光は認められなかった。(B)YPetプラスミドの封入時にも同様の結果が得られた。誤差小節は、15分の時間枠の間に示された時間における測定値の標準偏差を表します。
図5:FRETアッセイ。(A) ドナー放出およびFRETシグナル(受入器放出)に対する時間t=0で蛍光レベルを開始する。t= 2.5hでは、ドナーは発光量の増加を示し、FRET信号は減少した。(B) 小胞内で親水性ELPのみが発現した場合、FRETシグナルとドナー放出は一定のままでした。誤差小節は、15分の時間枠の間に示された時間における測定値の標準偏差を表します。
補足ファイル:すべてのプラスミド配列を含む遺伝子配列を取り除く。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
フィルムの水分補給は、小さなユニラメラ小胞の作成のための一般的な手順です。故障の主な原因は、手順で使用される材料の誤った取り扱いです。
当初、ELPは大腸菌細胞によって産生される。ELP精製後の収率は、重要なステップの間にプロトコルがどの程度慎重に行われるかに応じて大きく異なる場合があります。これらは逆温度サイクリング(ITC)ステップと降水後のELPの再サスペンションです。精製のために、我々は、pHを酸性に変え、親水性ブロック内のグルタミン酸側鎖のプロトネーションにつながるリン酸の添加を通じてペプチドの疎水性崩壊を引き起こした。このステップの後、両方のブロックはRTで疎水性である。イオン強度を一定に保つために塩分が既に溶液中にある酸を用いることを好ましいが、塩酸などの他の酸も使用できる。ELP産生の収率を高めるために、塩は遷移温度Ttを減少させ、ELPをより疎水性にするので、コーセレーションプロセスを強化するために追加の塩を加えることができる。通常、塩化ナトリウムが使用されますが、硫酸ナトリウムなどのコスモトロピック塩ははるかに優れていますが、塩濃度は溶液限界に近い場合があります。水風呂を使用して追加の加熱は、さらに収量を増加させることができる。
もう一つの重要なステップは、ELPペレットの赤化溶解です。ELP溶解度を最大限に高めるには、溶液を事前に冷却し、迅速なpH調整によりペレットをより速く溶解させることができます。pHは、このプロセス中に数回再調整する必要があるかもしれません。さらなる改善のために、サンプルは4°Cで冷蔵庫に貯えることができるし、サンプルの揺れを避けるべきである。塩を交換するためには、精製プロトコルの末端に記載された透析工程が好ましいべきである。原則として、ITCは、塩含有上清からペプチドを分離するために使用することができる。しかし、以前の塩濃度に応じて、残留塩はまだこのペレットで見つけることができます。さらに、透析は、前述のように損失なしで実験に必要なペプチドを濃縮するために使用することができる。
次の重要なステップは、クロロホルム/メタノール混合物の蒸発です。減圧での蒸発中に、沸騰の遅延は、スプラッタや乱流を引き起こす可能性があり、ガラスビーズの損失が大きい場合があります。これはフィルターかティッシュを使用して防ぐことができる。デシケータを使用する場合も同じ問題が発生しますが、丸底フラスコの開口部にアルミ箔を使用してこれを防ぐことができます。ELPコーティングガラスビーズの取り扱いには、使い捨て防止マイクロスパチュラを使用することをお勧めします。
PBSや転写ミックスなどの様々な腫脹溶液を使用した小胞の腫脹は簡単で、エラーが少ない。ただし、TX-TL システムでは、最大 10% のバッチからバッチへのバリエーションが発生する可能性があります。この問題を最小限に抑えるために、すべての実験は、最大3,000回の反応に使用できる無細胞抽出物の1つのバッチでのみ行われるべきです。水分補給後、小胞含有量および外溶液が腫脹溶液である。これは、内側と外側の小胞間の浸透圧差を変化させかねないため、外部溶液の精製を行うべきではない。その結果、制御不能なサイズの変化や小胞の破裂が起こり得る。したがって、外部で可能な反応は抑制されるべきである。反応に応じて、これは、例えば、DNase Iを添加して現在のDNAを消化するか、または翻訳を阻害するカナマイシンなどの抗生物質を添加することによって行うことができる。
ガラスビーズからのフィルム水分補給は、他の調製方法と比較した場合、いくつかの利点があります。溶媒注射とは対照的に、初期溶媒が完全に蒸発し、ペプチドが水溶液中で水分補給されるので、溶媒のエマルジョン相転写またはマイクロ流体変位は必要ない。したがって、ガラスビーズ法は、TX-TLなどの高感度サンプルに特に適しており、他の方法で使用される残留有機溶媒によって著しく影響を受けたり破壊されたりする可能性があります。さらに、プロトコルは簡単で、エラーが発生しやすく、簡単にスケールアップできます。表面と体積比が大きいため、少量のガラスビーズのみが必要となり、高スループットで高度な並列化が可能です。
その主な欠点として、ガラスビーズ法は、蛍光顕微鏡では観察できない小さなユニラメラ小胞の作成にのみ有用である。記載された方法は、単一小胞のダイナミクスの顕微鏡的観察が望まれる場合には幾分制限され、これは時には必要である(例えば、潜在的な小胞分裂過程を観察する場合)。さらに、SUVの小型化は、ペプチド封入プラスミドなどの低濃縮成分の封入を制限し、ペプチドの比較的低い発現を説明する。基になるカプセル化プロセスはポアソンプロセスであるため、95%のカプセル化確率を保証するには、特定の成分の濃度が少なくとも150 nMである必要があります。従って、これらの実験において小胞サイズのこのような大きな増加を観察することができることは非常に顕著である。
ここで提示されるプロトコルは、研究者がエラスチン様ポリペプチドからペプチドベースの小胞を作成することを可能にします。また、脂肪酸またはリン脂質から作られた古典的なコンパートメントに魅力的な代替手段を表すペプチド膜によってカプセル化された人工細胞様構造を生成する機会を開きます。ペプチドは、細胞のない環境(例えば、ここで使用されるTX-TLシステム)で容易に発現することができるという利点があり、これは小胞内の転写翻訳プロセスに直接膜成長の結合を可能にする。さらに、ElPは、輪郭の長さ、使用されるデブロックの疎水性/親水性、pHまたはイオン強度などの刺激に対する感受性などの特定の物理化学的パラメータに設計および調整することができます。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。
Acknowledgments
DFG TRR 235(生命の出現、プロジェクトP15)、欧州研究評議会(交付契約第694410 AEDNA)、およびTUM国際科学技術研究科(プロジェクトNo.9.05)を通じた財政支援に感謝します。.私たちは、サンプルの準備で彼女の助けをE.ファルゲンハウアーに感謝します。我々は、TX-TLシステムと有用な議論に対する彼らの助けに対して、A.デュビンとM.シュワルツ・シリングに感謝します。我々は、有益な議論のためにN.B.オランダに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
| 3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| 5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
| alkine-conjugated Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
| alkine-conjugated Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
| BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
| Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Chloramphenicol | Carl Roth | 3886.3 | |
| Chloroform | Carl Roth | 4432.1 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| CTP | USB | 14121 | |
| CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
| DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Ethanol | Carl Roth | 9065.2 | |
| Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| Glass beads, acid-washed | Sigma-Aldrich | G1277 | |
| GTP | USB | 16800 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
| LB Broth | Carl Roth | X968.2 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| Methanol | Carl Roth | 82.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) | Baseclick | BCL-033-5 | |
| PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
| pH stripes | Carl Roth | 549.2 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
| Phosphate-buffered saline | VWR | 76180-684 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| Polyethyleneimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
| Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
| Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| RNAPol reaction buffer | NEB | B9012 | |
| RNase inhibitor murine | NEB | M0314S | |
| RNaseZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
| rNTP | NEB | N0466S | |
| Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
| RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | 8655.1 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile-filtered (0.22 µm filter) | Carl Roth | XH76.1 | |
| T7 polymerase | NEB | M0251S | |
| TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Tris base | Fischer | BP1521 | |
| tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
| UTP | USB | 23160 |
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