Summary
Burada sunulan peptid tabanlı Küçük unilamellar veziküller büyüme yeteneğine oluşturulması için protokoller vardır. Membran peptid vesiculo üretiminde kolaylaştırmak için, bu veziküller bir transkripsiyon-çeviri sistemi ve peptid-kodlama Plasmid ile donatılmıştır.
Abstract
Biyokimyasal reaksiyonlar bölümlendirme sentetik hücrelerin merkezi bir yönüdür. Bu amaçla, peptid tabanlı reaksiyon bölmeleri lipozomlar veya yağlı asit bazlı veziküller için cazip bir alternatif olarak hizmet vermektedir. Dıştan veya veziküller içinde, peptidler kolayca ifade ve membran öncüleri sentezini basitleştirebilirsiniz. Burada sağlanan, cam boncuklardan su kaybı-rehidrasyon kullanan amphiphilik elastin benzeri polipeptidler (ELP) temelinde ~ 200 Nm çapları ile veziküllerin oluşturulması için bir protokoldür. Ayrıca sunulan bakteriyel ELP ifadesi ve ters sıcaklık Bisiklet yoluyla arıtma için protokoller, hem de floresan boyalar ile onların kovalent functionalization. Ayrıca, bu raporda bir biyokimyasal reaksiyon için daha az karmaşık bir örnek olarak ELP veziküller içinde RNA aptamer dBroccoli transkripsiyon etkinleştirmek için bir protokol açıklanmaktadır. Son olarak, bir protokol sağlanır, hangi floratik proteinleri ve membran peptid vesiculo ifadesinde sağlar, vezikül büyüme ikincisi sonucu sentezinde ise.
Introduction
Sentetik canlı hücresel sistemlerin oluşturulması genellikle iki farklı yöne yaklaştı. Yukarıdan aşağı yöntemle, bir bakterinin genomu temel bileşenlerine düşer, sonuçta minimal bir hücreye yol açılır. Aşağıdan yukarı yaklaşımda, yapay hücreler, fonksiyonel olarak tutarlı bir hücre benzeri sisteme entegre edilmesi gereken moleküler bileşenlerden veya hücresel alt sistemlerinden de Novo monte edilir.
De Novo yaklaşımı, gerekli biyokimyasal bileşenlerin bölümlendirme genellikle fosfolipidler veya yağ asitleri1,2,3,4yapılan membranların kullanılarak elde edilir. Çünkü "modern" hücre membranlarının ağırlıklı olarak fosfolipidler oluşur, yağ asitleri prebiyotik membran muhafazaları makul adaylar kabul edilir ise5,6. Yeni membranların oluşumu veya membran büyümesini kolaylaştırmak için, amphiphilik yapı taşları dış7 veya ideal bir membranlı bölme içinde üretim ile ilgili anabolik süreçleri kullanarak sağlanmalıdır4 ,8.
Lipid sentezi nispeten karmaşık bir metabolik süreçtir iken, peptidler hücre içermeyen gen ifade reaksiyonları kullanarak oldukça kolay üretilebilmektedir9,10. Bu nedenle, amphiphilik peptidler tarafından oluşturulan peptid membranların büyüme edebiliyoruz yapay hücre taklit için muhafazaları olarak lipid membranlara ilginç bir alternatif temsil11.
Amphiphilik elastin-gibi di-blok kopolimerler (ELPs) peptidler, bu tür membranların için yapı taşı olarak hizmet verebilir çekici bir sınıftır12. ELPS temel amino asit sırası motif (gagvp)n, burada "a" prolin ve "n" dışında herhangi bir amino asit olabilir motifi tekrarı sayısı13,14,15,16,17 . ELPs esas olarak glutamik asit11oluşan bir hidrofilik blok ve ağırlıklı olarak fenilalanin içeren bir hidrofobik blok ile oluşturulmuştur. PH ve tuz konsantrasyonu gibi bir ve çözüm parametrelerine bağlı olarak, ELPS sıcaklık tt'de sözde ters sıcaklık geçişi sergiler, peptidler hidrofilik bir hidrofobik tamamen geri dönüşümlü faz geçişi geçmesi Durum. Peptidler sentezini kullanarak veziküller içinde kolayca uygulanabilir "TX-TL" bakteriyel hücre ekstresi11,18,19,20,21, hangi sağlar birleştirilmiş transkripsiyon ve çeviri reaksiyonları için gerekli tüm bileşenleri.
TX-TL sistemi birlikte kapsüllenmiş, DNA şablonu ile ELP 'Ler, cam boncuklardan su kaybı-rehidrasyon kullanan ELPS veziküllerine sağlam bir destek olarak kodlanıyor. Veziküllerin oluşumu, boncuk yüzeyinden kuru peptitlerin rehidrasyon yoluyla oluşur11. Vezikül oluşumu için22 diğer yöntemler, potansiyel olarak daha düşük polydispersity ve daha büyük vezikül boyutlarını (örn. Elektro-oluşum, emülsiyon faz transferi veya mikrofluidik tabanlı Yöntemler) gösterebilir. Kapsülleme yönteminin canlığını sınamak için, fluorogenic aptamer dBroccoli23 ' ün TRANSKRIPSIYONU, TX-TL sistemi ile gen ifadesinden daha az karmaşık olan11' i alternatif olarak kullanılabilir.
Vesiculo membran yapı taşları ve membran içine daha sonra birleşmesi ifadesi nedeniyle, veziküller büyümeye başlar11. ELPs membran birleşme bir FRET tahlil aracılığıyla gösterilebilir. Bu amaçla, ilk vezikül nüfusun oluşumu için kullanılan ELPs bir FRET çifti oluşturan eşit hisseler floresan boyalar ile konjuated edilmelidir. Vesiculo 'da etiketli olmayan ELPs 'in ve membranın içine birleşmesi üzerine, membran içinde etiketli ELPs seyreltilir ve dolayısıyla FRET sinyali11' i düşürür. Konjugasyon için çok yönlü ve ortak bir yöntem olarak, bakır katalizlü Azide-alkyne halkakatılma kullanılır. Tris (benzyltriazolylmethyl)-Amin gibi bir stabilizasyon ligand kullanımı ile, reaksiyon reaksiyonlarının hidroliz olmadan bir fizyolojik pH 'da sulu bir çözelti yapılabilir11, hangi konjugasyon reaksiyonlar için uygun olan peptidler dahil.
Aşağıdaki protokol büyüyen ELP tabanlı peptidosomes için hazırlık ayrıntılı bir açıklamasını sunar. Cam boncuk metodunu kullanarak peptidler ve vezikül oluşumunun ifadesi açıklanmıştır. Ayrıca, flororojenik dBroccoli aptamer ve ELP veziküller içinde protein ifadesi için transkripsiyon-çeviri reaksiyonu transkripsiyon nasıl uygulanacağı açıklanmıştır. Son olarak, sağlanan bir FRET tahlil ile vezikül büyümesini kanıtlamak için kullanılabilecek fluorophores ile ELPs konjugasyon için bir işlemdir11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. elastin-benzeri polipeptitlerin ifadesi
- 1. gün: başlangıç kültürünün hazırlanması ve peptit ifadesi için sarf malzemeleri
- Hazırlamak ve otoklav ifade kültürü şişeler (4 x 2,5 l) ve 3 L lb orta. 1 l lb orta için 1 l ultra saf su lb toz 25 gr ekleyin.
- 100 ml lb orta, 50 μL steril filtre (0,22 μm filtre) kloramfenikol çözeltisi (EtOH 'da 25 mg/ml) ve 50 μL steril filtreli (0,22 μm filtre) karbenikilin çözeltisi (100 mg/ml,% 50 EtOH ve% 50 ultra saf su) ile bir Starter kültürü hazırlayın.
- E. coli strain bl21 (de3) plyss ile pET20b (+) ifade vektör polypeptid DIZISI MGHGVGVP ((GEGVP)4(Gvgvp) 4 ((gfgvp) 4 (gvgvp))3 içeren bir önceden yapılmış bakteriyel stok küçük bir çizgi ekleyin (Gfgvp)4GWP (EF olarak kısaltılmış), ön ısıtılan 100 ml marş kültürüne ve 37 °c ' de 16 h ile, bir sallayarak Kuluçl (E. coli suşları ve vektörler talep üzerine kullanılabilir) ile 250 rpm için inküyasyon.
- Ön-sıcak ifade kültür şişeler ve lb medya 37 ° c gece böylece onlar ertesi gün için hazırlanır.
- 2. gün: protein ifadesi
- 750 ml her ifade kültürü Flask, 375 μL steril filtre (0,22 μm filtre) kloramfenikol stok (25 mg/ml EtOH) ve 375 μL steril filtre (0,22 μm filtre) karbenikilin stok (100 mg/ml% 50 EtOH ve% 50 ultra saf su) ekleyin.
- Antibiyotik dağıtmak için ajitasyon sonra, 600 Nm (OD600) optik yoğunluk ölçümü için bir referans örnek olarak medyanın 2 ml alın.
- İfade Flask için başlangıç kültürü 7,5 mL ekleyin ve 250 rpm ile 37 °C ' de 1 h için inküye.
- Bu adımda her Flask OD600 her 20 dk kontrol edilecektir sonra.
- Optik yoğunluk yaklaşık 0,8 ulaştığında sıcaklığı 16 °c ' ye düşürebilir ve her ifade Flask içine ultra saf suda 750 μL 1 M steril filtrelenmiş β-isoprohacim thiogalactoside (IPTG) ekleyerek peptid ifadesine neden olur.
- 250 rpm ile 16 h için 16 °C ' de indüklenen bakteriler ile ifade Flask kuluçk.
- 3. gün: ifade edilen polipeptit ekstraksiyonu
- Hasat sonrası hücre peletleri kütlesinin belirlenmesini sağlamak için santrifüjleme Flask ön tartın.
- 4.000 x g ve 4 °c ' de ön soğutmalı santrifüjle 20 dakika santrifüj yoluyla ifade flsordan tüm bakterileri topla.
- Süpernatant dökün ve steril bir kağıt havlu üzerinde santrifüj şişeler leke.
- Santrifüjleme flsorlar tartmak ve hücre Pelet kütlesi hesaplayın.
- 750 mL 'Lik orijinal hücre kültüründen, pipetleme ile 15 mL fosfat-tamponlu tuz (PBS, pH 7,4) içinde ve 4 °C ' de 20 dakika için 4.000 x g 'de Santrifüjden aşağı Pelet edilen hücreleri resuspend. Süpernatant dökün ve steril bir kağıt havlu üzerinde santrifüj şişeler leke.
- PBS (pH 7,4) kullanarak 1 gram hücre peleti başına 2 ml tampon içinde lizis adım için hücre peleti resuspend lizozim (1 mg/ml), 1 mm phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF), 1 mm benzamidin ve 0,5 U DNase ı ile desteklenmektedir.
- Bir sonicator ile buz üzerinde daha fazla lizis için hücreleri sonikat 8 W için 9 dakika alternatif 10 s sonication ve 20 s duraklatma adımları, izleyen bir 9 dakika duraklama sırasında örnek buzda soğutulması gereken. Bir kez daha 9 dk sonication adım tekrarlayın.
- Nüklik asit yağış için 1 L orijinal hücre kültürü başına% 10 (w/v) polileneimine (PEı) 2 mL ekleyin.
- Numuneyi 2 mL santrifüjli tüplere dağıtın ve 60 °C ' de 10 dk, 4 °C ' de 10 dakika boyunca inkübasyon yapın.
- Solüsyonu 4 °C ' de 10 dakika 16.000 x g 'de santrifüjle ve ELP 'yi içeren süpernatant topla.
- Ters sıcaklık Bisiklet ile protein arıtma:
- Peptit hidrofilik parçası hidrofobik geçiş ve toplama neden 2 pH için süpernatant ayarlayın. PH ayarlamak için, fosforik asit ve sodyum hidroksit kullanılır. pH çizgileri pH seviyesini belirlemek için yeterlidir.
- Numunenin arıtma verimi artırmak için, örnek 60 °C ısı ve 2 M 'ye kadar sodyum klorür ekleyin.
- Daha sonra, numuneyi 16.000 x g 'de Oda SıCAKLıĞıNDA (RT) 10 dakika santrifüjün.
- Süpernatant atın ve PBS içinde Pelet yeniden çözülür (ancak ilk hacminin sadece yarısı önceki adıma göre kullanılır).
- PH 'yi fosforik asit ve sodyum hidroksit ile 7 ' ye ayarlayın. pH çizgileri pH belirlemek için yeterince doğrudur.
- Numuneyi daha sonra 16.000 x g 'de 4 °c ' de 10 dakika santrifüjine atın.
- Süpernatant toplayın ve adımlar 1.4.1 Repeat-1.4.6 kadar 3x toplam, adım 1.4.4 son tekrarı dışında, sadece su PBS yerine eklenir.
- Bir emilim spektrometresi ile peptidler konsantrasyonu ölçmek. 280 nm de 5500/M/cm tükenme katsayısı kullanın.
- 700 μM ' ye kadar ELP konsantrasyonunu ayarlayın.
2. cam boncuk yöntemi kullanarak vezikül üretimi
- Bir santrifüj vakum konsantratörü kullanarak 1,1 mM ELP çözeltisi konsantre.
- Konsantre ELP çözeltisi 200 μL 'i 1.250 μL, 2:1 kloroform/metanol karışımı ile karıştırın ve sonra da vorosimetif.
- 10 mL yuvarlak alt Flask için 1,5 g küresel cam boncuk (212 – 300 μm boyutunda) ekleyin.
- ELP ve kloroform/metanol karışımı içeren çözüm yuvarlak alt Flask ve mix nazik sallayarak ile ekleyin.
- Bir döner buharlaştırıcı için Flask bağlayın. Hızı 150 RPM 'ye ayarlayın ve sıvı oda sıcaklığında buharlanıncaya kadar yaklaşık 4 dakika için-0,2 x 105 PA (-200 mbar) basıncını düzenler.
- Kalan kloroform ve metanol Buharlaştırıcı sağlamak için en az 1 h için bir kurutucu içine yuvarlak alt Flask yerleştirin. Cam boncuk kaybını önlemek için, gevşek ekli alüminyum folyo yuvarlak alt Flask açılış etrafında sarılmış olmalıdır.
- Tek bir deney için mix 100 PBS gibi şişme çözeltisi 60 μL ile peptid kaplı cam boncuk mg. Bu numuneyi 25 °C ' de 5 dakika boyunca kulbe etme
- Örnek hızlı bir masa üstü santrifüjle cam boncuklar tortu için santrifüj.
- Veziküller içeren süpernatant toplamak için bir pipet kullanın.
3. veziküller Içinde RNA aptamer dBroccoli transkripsiyonu
- Bir RNase-Free çalışma ortamı oluşturmak için RNase dekontaminasyon çözümünü içeren mendiller ile laboratuar tezgahını temizleyin.
- T7 promotor ve dbroccoli dizisini içeren ssDNA 'yı (5 μM) karıştırın (gagacggtcgggtccatctgagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcagatgtcgagtagagtgtgggctc), yanı sıra, kodlamayan Strand (5 μM) ile birlikte nuclease-ücretsiz su ile tamamlayıcı Rnapol reaksiyon tampon [40 mm Tris-HCL (pH = 7,9), 6 mm MgCl2, 1 mm ditiyotreitol (DTT), ve 2 mm spermidine], transkripsiyon reaksiyonu için DNA şablonu hazırlamak için.
- Çözeltinin 5 dakika boyunca 90 °C ' de 30 dakika boyunca 20 °C ' ye kadar yavaş bir sıcaklık azalmasına neden olur.
- Hazırlamak 1 mM (5Z)-5-(3, 5-difluoro-4-hidroxybenzylidene)-2, 3-dimetil-3, 5-dihydro-4H-ımidazol-4-One (DFHBI) çözeltisi DMSO 5 mL DFHBI 1,26 mg çözünerek.
- Rnapol reaksiyon tamponunu karıştırarak transkripsiyon reaksiyonu hazırlayın [40 mm Tris-HCL (pH = 7,9), 6 mm MgCl2, 1 mm ditiyotreitol (DTT) ve 2 mm spermidin] ile 125 mm KCL, 15 mm MgCl2, 4 mm rntp, 10 μM dfhbi, 200 Nm DNA şablonu, 0,5 U/μL RNase önleyici murine ve su.
- Reaksiyon başlamadan hemen önce, 4 U/μL T7 polimeraz ekleyin.
- Adım 2,7 şişlik çözeltisi olarak bu reaksiyon karışımını kullanın ve genellikle 1 saat olan deneme süresi için 37 °C ' de Inküye yapın.
4. transkripsiyon-tercüme (TX-TL) reaksiyon
Not: Transkripsiyon-çeviri reaksiyonu için, bir ham hücre özü yanı sıra reaksiyon tampon ve DNA gereklidir. Ham hücre ekstresi Sun ve al.18' de açıklandığı gibi hazırlanır. TX-TL reaksiyonu için aşağıdakileri kullanın: 33% (v/v) ham E. coli özü, 42% (v/v) reaksiyon tamponu, ve% 25 (v/v) fenol-kloroform SAFLAŞTıRıLMıŞ DNA artı katkı maddeleri. Son konsantrasyonlarda yaklaşık 9 mg/ml protein, 50 mm HEPES (pH = 8), 1,5 mm ATP, 1,5 mm GTP, 0,9 mm CTP, 0,9 mm UTP, 0,2 mg/ml tRNA, 26 mm koenzim A, 0,33 mm nad, 0,75 mm kampı, 68 mm folinik asit, 1 mm spermidin , 30 mm Pep, 1 mm DTT,% 2 Peg-8000, 13,3 mm maltoz, 1 U T7 RNA polimeraz ve 50 nm plazmid DNA 'sı ultra saf suda.
-
DNA şablonu fenol-kloroform arıtma
- 5 ml lb orta ve 5 μL steril filtreli (0,22 μm filtre) karbenikilin çözeltisi (100 mg/ml,% 50 EtOH ve% 50 ultra saf su) ile altı gecelik kültür hazırlayın.
- DH5α E. coli içeren önceden üretilmiş bir bakteriyel stokta pET20b (+) ifade vektörü ile her ön ısıtılmış 5 ml gecede kültürüne küçük bir çizgi ekleyin ve 250 rpm ile 16 saat boyunca 37 °c ' de inküye yapın. Hangi peptit (EF) veya protein (YPet veya mVenus) ifade edilecek bağlı olarak, belirli bir kodlama Plasmid kullanılır.
- Kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi veya Zhang ve al.24tarafından sağlanan Protokolü izleyerek Plasmid 'i bir mini-Prep kiti ile ayıklayın.
- Ön arıtılmış Plasmid DNA 'Sı 100 μL hazırlayın (konsantrasyon 200 – 600 ng/μL arasında yer alabilir) ve 100 μL roti-fenol/kloroform/isoamill alkol (pH = 7.5 – 8.0) ile karışımı daha iyi faz ayrımı sağlamak için bir mikrosantrifüjlü tüpte kullanabilirsiniz.
- Tüp 6 x 'e kadar yavaşça ters çevirin ve RT 'de 16.000 x g 'de 5 dakika santrifüj yapın.
- Tüpün üst aşamasına 200 μL kloroform ekleyin ve tüpü 6x 'e çevirin.
- Numuneyi 16.000 x g 'de 5 dakıka boyunca RT olarak Santrifüjü.
- Ayrı bir tüp için süpernatant pipet ve etanol yağış için 3 M sodyum asetat 10 μL ekleyin.
- 1 mL-80 °C soğuk etanol ekleyin ve örneği 1 saat için-80 °C ' de saklayın.
- Numuneyi 4 °C ' de 15 dakika için 16.000 x g 'de Santrifüjü.
- Süpernatant decant ve eklemek 1 ml-20 °c soğuk 70% (v/v) etanol.
- 16.000 x g 'de 4 °c ' de 5 dakika Santrifüjü.
- Pipetleme ile sıvıyı çıkarın. DNA Pelet rahatsız değil dikkatli olun.
- Kalan etanol Buharlık için yaklaşık 15 dakika RT at örnek saklayın.
- Örnek konsantrasyonunu yaklaşık 300 Nm 'ye ayarlamak için numunenin ultra saf suyu ekleyin, bu da 260 Nm 'de emilimi ile ölçülür.
-
TX-TL reaksiyonu hazırlanması
- Hazırlanan ham hücre ekstresi ve buz üzerinde reaksiyon tampon çözüyor.
- Bir 60 μL reaksiyon karışımı için, plazmid DNA (Phenol-Chloroform) için 37,5 μL reaksiyon tampon ekleyin [50 mM HEPES (pH = 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 26 mM koenzim A, 0,33 mM NAD , 0,75 mM kampı, 68 mM folinik asit, 1 mM spermidin, 30 mM PEP, 1 mM DTT,% 2 PEG-8000, ve 13,3 mM maltoz), ardından da 28,7 μL ham hücre ekstresi eklenmesi. Son hacim için ultra saf su ile doldurun 58,8 μL.
- Reaksiyon başlamadan hemen önce, T7 RNA polimeraz çözeltisi 1,2 μL ekleyin ve numuneyi yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırın.
- Bu reaksiyon karışımını adım 2,7 bir şişlik çözeltisi olarak kullanın ve genellikle 4 – 8 saat olan deney süresince 29 °C ' de inküye yapın.
5. bakır katalizör Azide-alkyne Huisgen Cycloaddition aracılığıyla fluorophores ile elastin benzeri Polypeptides konjugasyon
- DMSO 'da 20 mM NHS-azid bağlayıcı (γ-azidobutirik asit N-hidroxysuccinimide ester) solüsyonu hazırlayın.
- PBS (8 g/l NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,42 g/L na2HPO4, 0,27 g/l K2hpo4, pH = 7,2) ve NHS-AZIDE (1,2 mM) ile ELP çözeltisi (600 ΜM) ile mix 250 μL ve RT 'de 12 saat boyunca inküye yapın.
- Numuneyi 10 kDa Dializ kasetinde yükleyin ve tuzları ve kalıntı NHS-Azide kaldırmak için 1 L ultra saf su içinde 12 h için 4 °c ' de saklayın.
- Aktif ELP 'yi (500 μM) alkyne-konjugasyonlu boya (500 μM), Cy5-alkyne veya Cy3-alkyne ile karıştırın.
- Bu numuneyi 1 mM TBTA (Tris (benzyltriazolylmethyl) Amin), 10 mM TCEP (Tris (2-karboksilil)-phosphine hidroklorür) ve 10 mM CuSO4 ile karıştırın ve 12 h Için 4 °c ' de Inküye yapın.
- Numuneyi 10 kDa Dializ kasetinde yükleyin ve 4 °c ' de 1 L 'de 12 saat boyunca ultra saf su ile saklayın, tuzları ve kalıntı alkyne-konjuyum boyaları çıkarın.
- Bu boya-modifiye ELPs Cy3 etiketli ELPs ve Cy5 etiketli ELPs bölüm iki peptidler benzer bir 1:1 karışımı kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vezikül üretimi
Şekil 1 , farklı şişme çözeltileri ve cam boncuk yöntemiyle hazırlanan veziküllerin iletim elektron MIKROSKOBU (Tem) görüntülerini gösterir (Ayrıca bakınız VOGELE ve al.11). Şekil 1a'da örnek için sadece PBS, veziküller oluşumunu kanıtlamak ve boyutlarını belirlemek için şişlik çözeltisi olarak kullanılmıştır. TX-TL şişme çözeltisi olarak kullanıldığında (Şekil 1B), veziküller de meydana gelmiştir. Cam boncuk yönteminin vezikül oluşumu üzerinde etkisi olduğunu göstermek için dinamik ışık saçılma (DLS) ölçümleri yapıldı. Şekil 2 , PBS (mavi) içinde cam boncuklar olmadan hazırlanan bir EF örneğinin ölçülen yoğunluğu otomatik ilişki eğrilerini ve şişlik çözeltisi (kırmızı) olarak PBS ile cam boncuk yöntemiyle HAZıRLANMıŞ bir EF örneğini gösterir. Boyutlar, bir kümülant fit25 hesaplanır ve 134 mil çapı ile sonuçlandı 25% bir polydispersity, veziküller cam boncuk yöntemi olmadan hazırlanan zaman. Cam boncuklar kullanıldığında, kümülant uyum% 21 bir polydispersity ile 168 nm çapı sonuçlandı.
Vesiculo transkripsiyon içinde 11 ' i
Şekil 3 , EF veziküller (yeşil) Içinde dBroccoli aptamer transkripsiyonu için zaman içinde floresan yoğunluğu profili gösterir. Negatif bir kontrol olarak, DNase ben şişlik çözeltisi eklendi ve böylece de vezikül oluşumu sırasında dahil (mavi). Ölçümler, 480 Nm 'de uyarılma ve 520 nm 'de emisyon ile floresan plaka okuyucusunda yapılmıştır.
Vesiculo protein ifadesinde 11 ' i
Şekil 4 , ELP veziküllerinin içinde floresan plaka okuyucusu kullanarak ifade edilen iki floresan proteinin floresan yoğunluğunu gösterir. 500 Nm ve emisyon 520 nm 'de uyarma yapılmıştır. Transkripsiyon-mVenus (Şekil 4A) çevirisi, ELP veziküldeki proteinlerin ifade dinamiklerini ve ifade seviyesini araştırmak için yapılmıştır. Vezikül oluşumundan sonra, vezisler ve dış çözelti içeriğinin aynı olduğunu dikkate almak önemlidir. Bu nedenle, vezikül dışında protein ifadesi bastırmak için, antibiyotik kanamisin dış çözüme eklendi. Kontrol olarak, kanamisin da şişlik çözeltisine eklendi, bu durumda vezikül içindeki protein ifadesi bastırıldı. Bu da küçük molekül kanamisin vezikül içinde kalır ve membran bu deneylerin zaman ölçeği üzerinde bu molekül için geçirgen olmadığını göstermektedir gösterir. Kanamisin membrandan yayılırsa, mvenus ifadesi bastırılmadı ve 5 saat içinde floresans daha yüksek olacaktır. İkinci deneyde YPet (Şekil 4b) ifadesi gerçekleştirilmiştir. Her iki protein de, örneğin GFP 'den daha hızlı bir olgunlaşma süresi sergilediğinden seçildi. Ayrıca, T7 promotör mVenus transkripsiyon ve YPet transkripsiyon için kullanılan bir kurucu promotör hem indüklenebilir ve sürekli ifade mümkün olduğunu göstermek için kullanıldı.
Fret tahlil 11 ' i
Şekil 5A membran içine ELP birleşme göstermek için gerçekleştirilen fret tahlil sonuçlarını gösterir. Bu nedenle, veziküller iki eşit konsantre fluorophore-peptid yapıları karışımı kullanılarak üretildi. Bunlar Cy3-EF (donör) ve Cy5-EF (Acceptor) idi. Zaman t = 0, başlangıç FRET düzeyi ölçüldü. Donör ve FRET sinyalinin sinyalleri membrandaki boyalar arasındaki ortalama mesafeye bağlıdır. Membran ELPs ifadesi üzerine, ek peptitler membran içine dahil, hangi FRET çiftleri arasındaki ortalama mesafeyi artırır. İkincisi, donör floresans artışıyla ölçüldü ve t = 2,5 h. Şekil 5B 'de fret sinyalinin azalması negatif kontrolü gösterir. Burada kanamisin, vezikül oluşumundan önce şişlik çözeltisine eklendi. Kanamycin protein ifadesini bastırır; Bu nedenle, FRET hiçbir değişiklik görülebilir. Bu tahlil sadece EF kuruluş gösterir dikkat etmek önemlidir.
Şekil 1: Temsılcısı Tem görüntüleri. (A) şişlik ÇÖZELTISI PBS 'de oluşturulan EF veziküller. (B) şişlik çözeltisi TX-TL 'd aoluşturulan EF veziküller. Ölçek çubukları = 200 Nm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Temsilci DLS veri. Yoğunluk otomatik ilişki eğrileri DLS tarafından ölçülür. Mavi eğrisi cam boncuk yöntemi olmadan hazırlanan PBS EF peptidler tasvir. Kırmızı eğrisi, şişlik çözeltisi olarak cam boncuk yöntemi ve PBS ile üretilen EF çözümünü tasvir ediyor. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Dbroccoli transkripsiyonu. EF veziküller içinde dBroccoli aptamer transkripsiyon temsili veri. Yeşil eğri, floresan sinyalini ve mavi eğrinin kapsüllenmiş DNase ı ile kontrol ölçümünü gösterir. lütfen buraya tıklayarak bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntüleyebilirsiniz.
Şekil 4: peptit veziküller Içinde protein ifadesi. (A) mvenus ve TX-TL ifade karışımı bir Plasmid KODLAMASı ELP veziküller içinde kapsüllenmiş. Yaklaşık 5 saat sonra, floresan doymuş. Antibiyotik kanamisin de kapsüllendiğinde, floresans görülmemiştir. (B) bir ypet plazmid kapsülleme üzerine benzer sonuçlar elde edildi. Hata çubukları, ölçülen değerlerin standart sapmasını, belirtilen sürede 15 dk. zaman dilimi boyunca temsil eder. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 5: FRET tahlil. (A) donör emisyonu ve fret sinyali (alıcı emisyonu) için zaman t = 0 sırasında floresans seviyeleri başlatılıyor. T = 2,5 h 'de donör artan emisyon gösterdi ve FRET sinyali azaldı. (B) veziküller içinde sadece hidrofilik ELP ifade edildiğinde, fret sinyali ve donör emisyonu sabit kaldı. Hata çubukları, ölçülen değerlerin standart sapmasını, belirtilen sürede 15 dk. zaman dilimi boyunca temsil eder. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Ek dosya: Tüm Plasmid dizileri RESP. gen dizileri içerir. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Film rehidrasyon Küçük unilamellar veziküller oluşturulması için ortak bir işlemdir. Başarısızlık ana kaynağı prosedürde kullanılan malzemelerin yanlış işleme olduğunu.
Başlangıçta, ELPs E. coli hücreleri tarafından üretilmektedir. ELP arıtma sonrası verim önemli adımlarla protokolün ne kadar dikkatle gerçekleştirileceğinden bağlı olarak farklılık gösterebilir. Bunlar ters sıcaklık bisiklet (ıTC) adım ve yağış sonra ELPs Resuspension vardır. Arıtma için, biz fosforik asit ilavesi ile peptit hidrofobik çöküşü tetikleyen, hangi Asidik pH değiştirir ve hidrofilik blok glutamik asit yan zincirler protonasyon yol açar. Bu adımda, her iki blok RT hidrofobik vardır. Bu tuz zaten iyonik gücü sabit tutmak için çözelti olan bir asit kullanmak için tercih edilir, ancak hidroklorik asit gibi diğer asitler de kullanılabilir. ELP üretiminin verimi artırmak için, ek tuzlar, çünkü tuz geçiş sıcaklığı Tt azalır ve ELP daha hidrofobik yapar, coacervation sürecini artırmak için eklenebilir. Genellikle sodyum klorür kullanılır, ancak sodyum sülfat gibi kosmotropik tuzlar çok daha iyidir, ancak tuz konsantrasyonu çözüm sınırına yakın olabilir. Su banyosunu kullanarak ek Isıtma verimi daha da artırabilir.
Başka bir kritik adım ELP Pelet redissolution olduğunu. Maksimum ELP çözünürlüğü için, çözelti önceden soğutulmuş olmalıdır ve hızlı bir pH ayarı Pelet daha hızlı çözülür yardımcı olabilir. PH bu işlem sırasında birkaç kez yeniden ayarlanması gerekebilir. Daha fazla iyileştirme için, numune buzdolabında 4 °C ' de depolanabilir ve numunenin sallayarak kaçınılmalıdır. Tuzları değiş tokuş etmek için, arıtma protokolünün sonundaki tarif edilen diyaliz adımı tercih edilmelidir. Prensip olarak, ıTC tuz içeren süpernatant gelen peptidler ayırmak için kullanılabilir. Ama önceki tuz konsantrasyonuna bağlı olarak, bu pelat hala kalan tuz bulunabilir. Ayrıca, diyaliz daha önce belirtildiği gibi kayıplar olmadan deneyler için gerekli peptidler konsantre için kullanılabilir.
Sonraki önemli adım, kloroform/metanol karışımı buharlaşma olduğunu. Azaltılmış basınçlarda buharlaşma sırasında, kaynama sırasında bir gecikme, cam boncuklar büyük kaybına neden olabilir Splatters veya turbulences neden olabilir. Bu filtreler veya dokular kullanılarak önlenebilir. Aynı sorun, kurutucu kullanıldığında ortaya çıkar, ancak yuvarlak alt Flask açılışında alüminyum folyo bunu önlemek için kullanılabilir. ELP kaplı cam boncuk işleme için, aynı zamanda kayıpları azaltır ve prosedürü basitleştirir tek kullanımlık antistatik mikro-spatula kullanmak için tavsiye edilir.
PBS ve transkripsiyon karışımı gibi çeşitli şişme çözeltileri kullanarak veziküllerin şişmesi basit ve daha az hata eğilimli. Ancak TX-TL sistemi için, toplu iş-toplu işlemden% 10 ' a kadar varyasyonlar ortaya çıkabilir. Bu sorunu en aza indirmek için, tüm deneyler, 3.000 reaksiyonlarına kadar kullanılabilecek tek bir hücre içermeyen ekstresi ile yapılmalıdır. Rehidrasyon sonrası, vezikül içeriği ve dış solüsyon şişlik çözümüdür. Bu iç ve dış vezikül arasındaki osrotik basınç farkını değiştirebilir, çünkü dış çözümün bir arıtma, gerçekleştirilmemelidir. Sonuç, kontrollü olmayan bir boyut değişimi ya da veziküller bile patlama olacaktır. Bu nedenle, dışarıdan olası reaksiyonlar sadece bastırılmalıdır. Reaksiyon bağlı olarak, bu yapılabilir, örneğin, ek DNase ben mevcut DNA sindirmek için veya kanamycin gibi antibiyotikler ekleyerek, hangi çeviri inhibe.
Cam boncuklardan film rehidrasyon diğer hazırlama yöntemleri ile karşılaştırıldığında çeşitli avantajları vardır. Solvent enjeksiyonu aksine, emülsiyon faz transferi veya solvent mikrofluidics deplasman gerekli değildir, çünkü ilk solvent tamamen buharlanmış, ve peptidler sulu solüsyon rehydrated vardır. Bu nedenle, cam boncuk yöntemi TX-TL gibi hassas örnekler için özellikle uygundur, bu da diğer yöntemlerle kullanılan kalan organik çözücüler tarafından önemli ölçüde etkilenebilir ya da tahrip edilebilir. Ayrıca, protokol basittir, daha az hata eğilimli ve kolayca ölçeklendirilebilir. Büyük yüzey hacmi oranı nedeniyle sadece küçük miktarlarda cam boncuk gereklidir ve yüksek verim ile yüksek derecede parallelization sağlar.
Ana dezavantajı olarak, cam boncuk yöntemi sadece floresans mikroskopisi ile gözlemlenemez Küçük unilamellar veziküllerin oluşturulması için yararlıdır. Tek veziküllerin dinamiklerinin mikroskobik gözlem istendiği zaman, bazen gerekli olan (örneğin, potansiyel vezişül bölme süreçlerini gözlemlerken) açıklanan yöntem biraz sınırlıdır. Ayrıca, SUV küçük büyüklüğü peptit-kodlama plazmid gibi düşük konsantre bileşenlerin kapsülleme sınırlar, peptidler nispeten düşük ifade açıklar. Altta yatan kapsülleme işlemi bir Poisson işlemidir ve böylece belirli bir bileşenin konsantrasyonu en az 150 nM olmalıdır ve% 95 ' lik bir kapsülleme olasılığını garanti eder. Bu nedenle, bu deneylerde vezikül boyutunda böyle büyük bir artış gözlemlemek mümkün olduğu oldukça dikkat çekicidir.
Burada sunulan protokol, araştırmacıların elastin benzeri polipeptitlerden peptid tabanlı veziküller oluşturmasını sağlayacaktır. Ayrıca, yağ asitleri veya fosfolipidlerden yapılmış klasik bölmeler için cazip alternatifler temsil peptid membranların kapsüllenmiş yapay hücre benzeri yapılar üretmek için fırsatlar açılır. Peptidler, membran büyümesini doğrudan vezikül içinde bir transkripsiyon-çeviri sürecine bağlamanıza olanak sağlayan, hücre içermeyen bir ortamda (örneğin, burada kullanılan TX-TL sisteminde) kolayca ifade edilmeleri açısından avantajlıdır. Ayrıca, ELPs tasarlanmış ve kontur uzunluğu, hydrophobicity/hidrofilisite kullanılan DeBlock ve pH veya iyonik gücü gibi uyaranlara duyarlılık gibi spesifik fizikokimyasal parametreler için ayarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.
Acknowledgments
Biz minnetle DFG TRR 235 (yaşam doğuşu, proje P15), Avrupa Araştırma Konseyi (Grant anlaşması No. 694410 AEDNA) ve TUM Uluslararası Enstitüsü bilim ve mühendislik ıGSSE (Proje No. 9,05) aracılığıyla mali destek kabul . Biz örnek hazırlama ile onun yardımı için E. Falgenhauer teşekkür ederiz. TX-TL sistemi ve yararlı tartışmalar konusunda yardım almak için A. Dupin ve M. Schwarz-Schilling ' e teşekkür ederiz. Biz yararlı tartışmalar için N. B. Holland teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
| 3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| 5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
| alkine-conjugated Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
| alkine-conjugated Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
| BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
| Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Chloramphenicol | Carl Roth | 3886.3 | |
| Chloroform | Carl Roth | 4432.1 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| CTP | USB | 14121 | |
| CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
| DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Ethanol | Carl Roth | 9065.2 | |
| Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| Glass beads, acid-washed | Sigma-Aldrich | G1277 | |
| GTP | USB | 16800 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
| LB Broth | Carl Roth | X968.2 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| Methanol | Carl Roth | 82.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) | Baseclick | BCL-033-5 | |
| PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
| pH stripes | Carl Roth | 549.2 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
| Phosphate-buffered saline | VWR | 76180-684 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| Polyethyleneimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
| Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
| Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| RNAPol reaction buffer | NEB | B9012 | |
| RNase inhibitor murine | NEB | M0314S | |
| RNaseZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
| rNTP | NEB | N0466S | |
| Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
| RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | 8655.1 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile-filtered (0.22 µm filter) | Carl Roth | XH76.1 | |
| T7 polymerase | NEB | M0251S | |
| TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Tris base | Fischer | BP1521 | |
| tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
| UTP | USB | 23160 |
References
- Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).
- Hardy, M. D., et al. Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).
- Scott, A., et al. Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes. PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).
- Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions. Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).
- Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells. Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).
- Zhu, T. F., Szostak, J. W. Coupled growth and division of model protocell membranes. Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).
- Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).
- Chu, H. -S., et al. Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system. Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).
- Martino, C., et al. Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures. Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).
- Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
- McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).
- Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
- Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets. Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).
- Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).
- Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).
- Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
