Interacties met en membraan Permeabilization van de mitochondriën van de hersenen door amyloid fibrils
Summary
Hier is een protocol voor het onderzoek van de interacties tussen inheemse vorm, prefibrillar, en volwassen amyloïde fibrillen van verschillende peptiden en eiwitten met mitochondriën geïsoleerd uit verschillende weefsels en verschillende gebieden van de hersenen.
Abstract
Een groeiende hoeveelheid bewijs geeft aan dat membraan permeabilization, met inbegrip van interne membranen zoals mitochondriën, is een gemeenschappelijk kenmerk en primaire mechanisme van amyloïde aggregaat-geïnduceerde toxiciteit in neurodegeneratieve ziekten. Echter, de meeste rapporten beschrijven de mechanismen van membraan verstoring zijn gebaseerd op fosfolipide modelsystemen, en studies direct targeting gebeurtenissen die zich voordoen op het niveau van biologische membranen zijn zeldzaam. Hier beschreven is een model voor het bestuderen van de mechanismen van amyloïde toxiciteit op membraan niveau. Voor mitochondriale isolatie wordt dichtheidsgradiënt gebruikt om preparaten met minimale myeline besmetting te verkrijgen. Na de mitochondriale membraan integriteit bevestiging, de interactie van amyloïde fibrillen die voortvloeien uit α-synucleine, runderinsuline, en kip eiwit lysozym (hewl) met rat hersenen mitochondriën, als een in vitro biologisch model, wordt onderzocht. De resultaten tonen aan dat de behandeling van de mitochondriën van de hersenen met fibrillar assemblies verschillende graden van membraan permeabilization en ROS inhoud Enhancement kan veroorzaken. Dit duidt op structuur afhankelijke interacties tussen amyloïde fibrillen en mitochondriaal membraan. Er wordt gesuggereerd dat biofysische eigenschappen van amyloïde fibrillen en hun specifieke binding aan mitochondriale membranen uitleg kunnen geven voor sommige van deze waarnemingen.
Introduction
Amyloïde-gerelateerde aandoeningen, bekend als amylodoses, vormen een grote groep van ziekten die worden gedefinieerd door het verschijnen van onoplosbare eiwit afzettingen in verschillende weefsels en organen1,2. Onder hen, neurodegeneratieve aandoeningen zijn de meest voorkomende vormen waarin eiwit aggregaten verschijnen in het centrale of perifere zenuwstelsel2. Hoewel een aantal mechanismen is voorgesteld om betrokken te zijn bij de toxiciteit van amyloïde aggregaten3, wijst een groeiend geheel van bewijsmateriaal op verstoring van de celmembraan en permeisatie als het primaire mechanisme van amyloïde pathologie4, 5. Naast plasma membraan, interne organellen (dat wil zeggen, mitochondriën) kan ook worden beïnvloed.
Interessant, opkomende bewijs suggereert dat mitochondriale dysfunctie speelt een cruciale rol in de pathogenese van neurodegeneratieve aandoeningen, met inbegrip van de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson6,7. In overeenstemming met deze kwestie, talrijke rapporten hebben aangegeven binding en accumulatie van amyloïde β-peptide, α-synuclein, huntingtine, en als-gebonden Mutant SOD1 eiwitten aan mitochondriën8,9,10, 11. het mechanisme van membraan permeisatie door amyloïde aggregaten wordt verondersteld te gebeuren door vorming van discrete kanalen (poriën) en/of door middel van een niet-specifiek detergens-achtige mechanisme5,12, 13. Het is opmerkelijk dat de meeste van deze conclusies zijn gebaseerd op rapporten met betrekking tot fosfolipide modelsystemen, en studies direct gericht op de gebeurtenissen die zich voordoen in biologische membranen zijn zeldzaam. Duidelijk, deze kunstmatige lipide bilayers niet noodzakelijkerwijs weerspiegelen de intrinsieke eigenschappen van biologische membranen, met inbegrip van die van de mitochondriën, die heterogene structuren en samengesteld uit een breed scala van fosfolipiden en eiwitten.
In de huidige studie, mitochondriën geïsoleerd van rat hersenen worden gebruikt als een in vitro biologisch model om te onderzoeken van de destructieve effecten van amyloïde fibrillen die voortvloeien uit α-synucleine (als een amyloidogenic eiwit), bovine insuline (als een model peptide tonen significante structurele homologie met humane insuline die betrokken zijn bij injectie-gelokaliseerde Amyloïdose), en kip eiwit lysozym (hewl; als een gemeenschappelijk model eiwit voor studie van amyloïde aggregatie). De interacties en mogelijke schade van mitochondriale membranen geïnduceerd door amyloïde fibrillen worden vervolgens onderzocht door het observeren van het vrijkomen van mitochondriale malaat dehydrogenase (MDH) (gelegen in de mitochondriale matrix) en mitochondriën reactieve zuurstof Soort (ROS) Enhancement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een schat aan experimentele resultaten ondersteunt de hypothese dat de cytotoxiciteit van fibrillar aggregaten significant wordt geassocieerd met hun vermogen om te interageren met en permeabilize biologische membranen4,5. Echter, de meeste van de gegevens zijn gebaseerd op kunstmatige lipide-bilayers die niet noodzakelijkerwijs de intrinsieke eigenschappen van biologische membranen weerspiegelen, die heterogene structuren met een breed scala van fosfolipiden en …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van de Onderzoeksraad van het Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), Zanjan, Iran.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma | 35845 | |
| Ammonium sulfate | Merck | 1012171000 | |
| Black 96-well plate | Corning | ||
| Black Clear-bottomed 96-well plate | Corning | ||
| Bovine insulin | Sigma | I6634 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| BSA essentially fatty acid-free | Sigma | A6003 | |
| Centrifuge | Sigma | ||
| Crystal clear sealing tape | Corning | ||
| CuSO4 | Sigma | 451657 | |
| Dialysis bag (cut off 2 KDa) | Sigma | D2272 | |
| Dounce homogenizer | Potter Elvehjem | ||
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Fluorescence plate reader | BioTek | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Cary Eclipse VARIAN | ||
| Folin | Merck | F9252 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Guillotine | Made in Iran | ||
| HCl | Merck | H1758 | |
| Hen Egg White Lysozyme (HEWL) | Sigma | L6876 | |
| Na2CO3 | Sigma | S7795 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S7907 | |
| NaOH | Merck | S8045 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
| Percoll | GE Healthcare | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | CS0030 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Potassium sodium tartrate | Sigma | 217255 | |
| Quartz cuvette | Sigma | ||
| Spectrophotometer | analytik jena | SPEKOL 2000 model | |
| Succinate | Sigma | S2378 | |
| Sucrose | Merck | 1076871000 | |
| Thermomixer | Eppendorph | ||
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
| Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tryptone | QUELAB | ||
| Water bath | Memmert | ||
| Yeast Extract | QUELAB | ||
| β-NADH | Sigma | N8129 |
References
- Merlini, G., Bellotti, V. Molecular mechanisms of amyloidosis. New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).
- Berg, I. . Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Linköping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , (2010).
- Kagan, B. L., Uversky, V. N., Fink, A. L. Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage. Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. , 223-236 (2006).
- Demuro, A., et al. Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers. The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).
- Kayed, R., et al. Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).
- Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer’s disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage. Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).
- Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. Mitochondrial alterations in Parkinson’s disease: new clues. Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).
- Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
- Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
- Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington’s disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
- Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
- Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. Amyloid peptide channels. The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).
- Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations. Nature. 418, 291 (2002).
- Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).
- Ghobeh, M., et al. Interaction of Aβ (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products. Peptide Science. 102, 473-486 (2014).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).
- Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria. Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).
- Hoyer, W., et al. Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions. Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).
- Weinreb, P. H., et al. NACP, a protein implicated in Alzheimer’s disease and learning, is natively unfolded. Biochimie. 35, 13709-13715 (1996).
- Porter, R. R. Partition chromatography of insulin and other proteins. The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).
- Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme. Biochimie. 30, 2790-2797 (1991).
- Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol. Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).
- Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products. Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).
- Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).
- Fink, A. L. The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein. Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).
- Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains. Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).
- Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. Lipid bilayer disruption by oligomeric α-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core. Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).
- Kourie, J. I., Henry, C. L. Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 29, 741-753 (2002).
- Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
- Bolognesi, B., et al. ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species. ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).
- Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content. Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).
- Roqanian, S., et al. Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action. International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).
- Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein. The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).
- Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains. Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).
- Devi, L., et al. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
- Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. Interaction of α-synuclein with biomembranes in Parkinson’s disease-role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).
- Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
- Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington’s disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
- Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
- Oladzad Abbasabadi, A., et al. Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1. International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).
