Interacciones con y la permeabilización de membrana de las mitocondrias cerebrales por Amiloide Fibrils
Summary
Aquí se proporciona un protocolo para investigar las interacciones entre la forma nativa, las fibrillas prefibrilares y las fibrillas amiloideas maduras de diferentes péptidos y proteínas con mitocondrias aisladas de diferentes tejidos y diversas áreas del cerebro.
Abstract
Un creciente cuerpo de evidencia indica que la permeabilización de la membrana, incluyendo membranas internas como las mitocondrias, es una característica común y el mecanismo primario de toxicidad inducida por agregadoa amiloide en enfermedades neurodegenerativas. Sin embargo, la mayoría de los informes que describen los mecanismos de interrupción de la membrana se basan en sistemas de modelos de fosfolípidos, y los estudios dirigidos directamente a los eventos que ocurren a nivel de membranas biológicas son raros. Descrito aquí es un modelo para estudiar los mecanismos de toxicidad amiloide a nivel de membrana. Para el aislamiento mitocondrial, el medio de gradiente de densidad se utiliza para obtener preparaciones con una contaminación mínima de la mielina. Después de la confirmación de la integridad de la integridad de la membrana mitocondrial, se investiga la interacción de las fibrillas amiloide derivadas de la sinucleína, la insulina bovina y el lysozima blanca de huevo de hien (HEWL) con las mitocondrias cerebrales de rata, como modelo biológico in vitro. Los resultados demuestran que el tratamiento de las mitocondrias cerebrales con conjuntos fibrilares puede causar diferentes grados de permeabilización de la membrana y mejora del contenido de ROS. Esto indica interacciones dependientes de la estructura entre las fibrillas amiloideas y la membrana mitocondrial. Se sugiere que las propiedades biofísicas de las fibrillas amiloideas y su unión específica a las membranas mitocondriales pueden proporcionar explicaciones para algunas de estas observaciones.
Introduction
Los trastornos relacionados con el amiloide, conocidos como amiloidosis, constituyen un gran grupo de enfermedades definidas por la aparición de depósitos de proteínas insolubles en diferentes tejidos y órganos1,2. Entre ellos, los trastornos neurodegenerativos son las formas más frecuentes en las que aparecen agregados proteicos en el sistema nervioso central o periférico2. Aunque se ha propuesto que una serie de mecanismos participen en la toxicidad de los agregados amiloide3 , un creciente cuerpo de evidencia apunta a la alteración de la membrana celular y la permeabilización como el mecanismo primario de la patología amiloide4, 5. Además de la membrana plasmática, los orgánulos internos (es decir, las mitocondrias) también pueden verse afectados.
Curiosamente, la evidencia emergente sugiere que la disfunción mitocondrial juega un papel crítico en la patogénesis de los trastornos neurodegenerativos, incluyendo la enfermedad de Alzheimer y Parkinson6,7. De acuerdo con este número, numerosos informes han indicado la unión y acumulación de amiloides-péptido, sinucleína, Huntingtin, y proteínas MUTANTes SOD1 vinculadas a ELA a las mitocondrias8,9,10, 11. Se cree que el mecanismo de permeabilización de la membrana por agregados amiloide ocurre ya sea a través de la formación de canales discretos (poros) y/o a través de un mecanismo no específico similar al detergente5,12, 13. Cabe destacar que la mayoría de estas conclusiones se han basado en informes que involucran sistemas de modelos de fosfolípidos, y los estudios dirigidos directamente a los eventos que ocurren en las membranas biológicas son raros. Claramente, estas bicapas de lípidos artificiales no reflejan necesariamente las propiedades intrínsecas de las membranas biológicas, incluidas las de las mitocondrias, que son estructuras heterogéneas y están compuestas por una amplia variedad de fosfolípidos y proteínas.
En el presente estudio, las mitocondrias aisladas de cerebros de ratas se utilizan como modelo biológico in vitro para examinar los efectos destructivos de las fibrillas amiloideas derivadas de la sinucleína (como proteína amiloidógena), insulina bovina (como un péptido modelo que muestra homología estructural significativa con insulina humana implicada en la amiloidosis localizada por inyección), y lisozima blanca de huevo de gallina (HEWL; como una proteína modelo común para el estudio de la agregación amiloide). Las interacciones y posibles daños de las membranas mitocondriales inducidas por las fibrillas amiloides se investigan observando la liberación de malato mitocondrial deshidrogenasa (MDH) (ubicado en la matriz mitocondrial) y oxígeno reactivo mitocondria (ROS).
Protocol
Representative Results
Discussion
Una gran cantidad de resultados experimentales apoya la hipótesis de que la citotoxicidad de los agregados fibrilares se asocia significativamente con su capacidad para interactuar y permeabilizar las membranas biológicas4,5. Sin embargo, la mayoría de los datos se basan en bicapas de lípidos artificiales que no reflejan necesariamente las propiedades intrínsecas de las membranas biológicas, que son estructuras heterogéneas con una amplia variedad de fosfo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación del Instituto de Estudios Avanzados en Ciencias Básicas (IASBS), Zanjan, Irán.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma | 35845 | |
| Ammonium sulfate | Merck | 1012171000 | |
| Black 96-well plate | Corning | ||
| Black Clear-bottomed 96-well plate | Corning | ||
| Bovine insulin | Sigma | I6634 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| BSA essentially fatty acid-free | Sigma | A6003 | |
| Centrifuge | Sigma | ||
| Crystal clear sealing tape | Corning | ||
| CuSO4 | Sigma | 451657 | |
| Dialysis bag (cut off 2 KDa) | Sigma | D2272 | |
| Dounce homogenizer | Potter Elvehjem | ||
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Fluorescence plate reader | BioTek | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Cary Eclipse VARIAN | ||
| Folin | Merck | F9252 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Guillotine | Made in Iran | ||
| HCl | Merck | H1758 | |
| Hen Egg White Lysozyme (HEWL) | Sigma | L6876 | |
| Na2CO3 | Sigma | S7795 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S7907 | |
| NaOH | Merck | S8045 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
| Percoll | GE Healthcare | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | CS0030 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Potassium sodium tartrate | Sigma | 217255 | |
| Quartz cuvette | Sigma | ||
| Spectrophotometer | analytik jena | SPEKOL 2000 model | |
| Succinate | Sigma | S2378 | |
| Sucrose | Merck | 1076871000 | |
| Thermomixer | Eppendorph | ||
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
| Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tryptone | QUELAB | ||
| Water bath | Memmert | ||
| Yeast Extract | QUELAB | ||
| β-NADH | Sigma | N8129 |
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