Interazioni con e Membrana Permeabilizzazione di mitocondri cerebrali di Amyloid Fibrils
Summary
Fornito qui è un protocollo per studiare le interazioni tra forma nativa, prefibrillare, e fibrille amiloidi mature di diversi peptidi e proteine con mitocondri isolati da diversi tessuti e varie aree del cervello.
Abstract
Un numero crescente di prove indica che la permeabilizzazione della membrana, comprese le membrane interne come i mitocondri, è una caratteristica comune e un meccanismo primario della tossicità indotta dall’aggregazione amiloide nelle malattie neurodegenerative. Tuttavia, la maggior parte dei rapporti che descrivono i meccanismi di interruzione della membrana si basano su sistemi di modelli fosforidi, e gli studi che si rivolgono direttamente agli eventi che si verificano a livello di membrane biologiche sono rari. Descritto qui è un modello per studiare i meccanismi di tossicità amiloide a livello di membrana. Per l’isolamento mitocondriale, il mezzo di pendenza di densità viene utilizzato per ottenere preparati con contaminazione da mielina minima. Dopo la conferma dell’integrità della membrana mitocondriale, viene studiata l’interazione delle fibrille amiloidi derivanti da z-sinucleina, insulina bovina e lisozomina dell’uovo di gallina (HEWL) con mitocondri cerebrali, come modello biologico in vitro. I risultati dimostrano che il trattamento dei mitocondri cerebrali con gruppi di fibrillari può causare diversi gradi di permeabilizzazione della membrana e miglioramento del contenuto ROS. Ciò indica interazioni dipendenti dalla struttura tra fibrille amiloidi e membrana mitocondriale. Si suggerisce che le proprietà biofisiche delle fibrille amiloidi e il loro legame specifico alle membrane mitocondriali possono fornire spiegazioni per alcune di queste osservazioni.
Introduction
I disturbi correlati all’amiloide, noti come amiloidosi, costituiscono un grande gruppo di malattie definite dalla comparsa di depositi di proteine insolubili in diversi tessuti e organi1,2. Tra questi, i disturbi neurodegenerativi sono le forme più frequentemente in cui gli aggregati proteici compaiono nel sistema nervoso centrale o periferico2. Sebbene siano stati proposti diversi meccanismi coinvolti nella tossicità degli aggregati amiloidi3, un corpo crescente di prove indica l’interruzione della membrana cellulare e la permeabilizzazione come meccanismo primario della patologia amiloide4, 5. Oltre alla membrana plasmatica, possono essere colpiti anche organelli interni (cioè mitocondri).
È interessante notare che le evidenze emergenti suggeriscono che la disfunzione mitocondriale svolge un ruolo critico nella patogenesi dei disturbi neurodegenerativi, tra cui il morbo di Alzheimer e Parkinson6,7. In conformità con questo problema, numerose relazioni hanno indicato il legame e l’accumulo di proteine amiloidi di amiloide, di SOD1 mutanti amiloidi, di sinucleina, huntingtina e di SOD1 mutanti legati alla SLA alle proteine dei mitocondri8,9,10, 11.Si ritiene che il meccanismo della permeabilizzazione della membrana mediante aggregati amiloidi avvenga attraverso la formazione di canali discreti (pori) e/o attraverso un meccanismo non specifico simile al detergente5,12, 13. È interessante notare che la maggior parte di queste conclusioni si sono basate su relazioni che coinvolgono sistemi di modelli fosforidi, e gli studi che mirano direttamente agli eventi che si verificano nelle membrane biologiche sono rari. Chiaramente, questi bistrati lipidi artificiali non riflettono necessariamente le proprietà intrinseche delle membrane biologiche, comprese quelle dei mitocondri, che sono strutture eterogenee e composte da un’ampia varietà di fosfolipidi e proteine.
Nel presente studio, i mitocondri isolati dal cervello del ratto sono utilizzati come modello biologico in vitro per esaminare gli effetti distruttivi delle fibrille amiloidi derivanti da omologia strutturale significativa con insulina umana coinvolta nell’amiloidosi imdovelva-localizzata) e lisozima bianco d’uovo di gallina (HEWL; come proteina modello comune per lo studio dell’aggregazione di amiloide). Le interazioni e i possibili danni delle membrane mitocondriali indotte dalle fibrille amiloidi vengono quindi studiati osservando il rilascio di dihydrogenasi di malata malato mitocondriale (MDH) (situato nella matrice mitocondriale) e ossigeno reattivo mitocondriale (ROS).
Protocol
Representative Results
Discussion
Una ricchezza di risultati sperimentali supporta l’ipotesi che la citotossicità degli aggregati fibrillare sia significativamente associata alla loro capacità di interagire con le membrane biologiche4,5. Tuttavia, la maggior parte dei dati si basa su bistrati lipidici artificiali che non riflettono necessariamente le proprietà intrinseche delle membrane biologiche, che sono strutture eterogenee con un’ampia varietà di fosfolipidi e proteine. Qui, usando i mit…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Consiglio di ricerca dell’Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), s.r.l.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma | 35845 | |
| Ammonium sulfate | Merck | 1012171000 | |
| Black 96-well plate | Corning | ||
| Black Clear-bottomed 96-well plate | Corning | ||
| Bovine insulin | Sigma | I6634 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| BSA essentially fatty acid-free | Sigma | A6003 | |
| Centrifuge | Sigma | ||
| Crystal clear sealing tape | Corning | ||
| CuSO4 | Sigma | 451657 | |
| Dialysis bag (cut off 2 KDa) | Sigma | D2272 | |
| Dounce homogenizer | Potter Elvehjem | ||
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Fluorescence plate reader | BioTek | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Cary Eclipse VARIAN | ||
| Folin | Merck | F9252 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Guillotine | Made in Iran | ||
| HCl | Merck | H1758 | |
| Hen Egg White Lysozyme (HEWL) | Sigma | L6876 | |
| Na2CO3 | Sigma | S7795 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S7907 | |
| NaOH | Merck | S8045 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
| Percoll | GE Healthcare | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | CS0030 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Potassium sodium tartrate | Sigma | 217255 | |
| Quartz cuvette | Sigma | ||
| Spectrophotometer | analytik jena | SPEKOL 2000 model | |
| Succinate | Sigma | S2378 | |
| Sucrose | Merck | 1076871000 | |
| Thermomixer | Eppendorph | ||
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
| Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tryptone | QUELAB | ||
| Water bath | Memmert | ||
| Yeast Extract | QUELAB | ||
| β-NADH | Sigma | N8129 |
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