Preparação de amostras para espectrometria de ionização de eletrospray de sonda

Summary

Este artigo introduz métodos de preparação de amostras para um método analítico único em tempo real baseado na espectrometria de massa ambiente. Este método nos permite realizar a análise em tempo real das moléculas biológicas in vivo sem nenhum pré-tratamento especial.

Abstract

A espectrometria de massa (MS) é uma ferramenta poderosa em química analítica porque fornece informações muito precisas sobre moléculas, como proporções de massa para carga(m/z),que são úteis para deduzir pesos moleculares e estruturas. Embora seja essencialmente um método analítico destrutivo, os recentes avanços na técnica de ionização ambiental nos permitiram adquirir dados, deixando o tecido em um estado relativamente intacto em termos de integridade. A ionização de eletrospray de sonda (PESI) é um método direto chamado porque não requer pré-tratamento complexo e demorado de amostras. Uma agulha fina serve como catador de amostras, bem como um emissor de ionização. Com base na propriedade muito afiada e fina da ponta da sonda, a destruição das amostras é mínima, permitindo-nos adquirir as informações moleculares em tempo real de seres vivos in situ. Aqui, introduzimos três aplicações da técnica PESI-MS que serão úteis para pesquisa e desenvolvimento biomédico. Trata-se da aplicação ao tecido sólido, que é a aplicação básica dessa técnica para o diagnóstico médico. Como esta técnica requer apenas 10 mg da amostra, pode ser muito útil nos ambientes clínicos de rotina. A segunda aplicação é para diagnósticos médicos in vitro onde o soro sanguíneo humano é medido. A capacidade de medir amostras de fluidos também é valiosa em vários experimentos biológicos onde um volume suficiente de amostra para técnicas analíticas convencionais não pode ser fornecido. A terceira aplicação se inclina para a aplicação direta de agulhas de sonda em animais vivos, onde podemos obter dinâmicas em tempo real de metabólitos ou drogas em órgãos específicos. Em cada aplicação, podemos inferir as moléculas que foram detectadas pela ESM ou usar inteligência artificial para obter um diagnóstico médico.

Introduction

Espectrometria de massa (MS) é uma realização tecnológica do reducionismo; reduz o objeto de análise a uma unidade que pode ser interpretada com base em espécies moleculares ou cascatas. Portanto, é um método representativo de química analítica. É composto por quatro processos: ionização, análise, detecção e aquisição espectral. Como a ionização da molécula é o primeiro processo de espectrometria em massa, ela geralmente restringe a forma dos analytes a serem processados. A maioria dos procedimentos de ionização requerem a destruição da estrutura, morfologia e processos biológicos em tempo real de amostras orgânicas. Por exemplo, a ionização de eletrospray (ESI) exige que as amostras estejam em estado líquido para ionização eficiente¹. As amostras, portanto, devem passar por uma complexa preparação bioquímica, que altera a composição das moléculas. Alternativamente, enquanto a desorização do laser auxiliado por matriz (MALDI) pode reconstruir mapas moleculares de tecido seccionado fino^2,3, sua eficiência de ionização é muito baixa para detectar todas as moléculas nas amostras, e é particularmente ruim em analisar ácidos graxos. Considerando essas limitações, a ionização de eletrospray de sonda (PESI)⁴ pode ser usada para observar as mudanças em tempo real nos sistemas biológicos in situ sem destruir a integridade estrutural⁵, enquanto o organismo biológico observado está tecnicamente em um estado vivo. Uma agulha muito fina é usada neste caso que serve simultaneamente como um catador de amostras e um emissor de íons. Isso significa que as complexas sequências de pré-tratamento amostral podem ser contornadas para obter espectros de massa que refletem os componentes moleculares do sistema vivo in situ.

Existem vários outros métodos de ionização que rivalizam com pesi-ms. Um deles é a espectrometria rápida de ionização evaporativa (REIMS)⁶. Essa técnica funciona bem durante a cirurgia porque é montada com uma faca elétrica e recolhe a pluma de íon gerada durante a incisão. Embora o REIMS seja muito útil para a cirurgia, é essencialmente um método destrutivo que requer a ablação elétrica do tecido. Portanto, não é útil para a análise detalhada de células e tecidos em uma amostra preparatória ou em análises laboratoriais. Além disso, por coletar uma grande quantidade de pluma contendo detritos teciduais, requer uma manutenção longa dos dispositivos após cada uso, limitando assim o uso desta máquina a procedimentos cirúrgicos especiais. Um método semelhante, chamado espectrometria de ionrômetro de ionrização de desorização a laser (LDI-MS)⁷, é outra técnica que não é invasiva e útil para a análise da superfície. Como essa técnica é boa em escanear a superfície de um espécime, ela alcança uma análise bidimensional abrangente como a espectrometria de massa de imagem MALDI^8,9. No entanto, como o LDI-MS só é aplicável à análise da superfície, pesi-MS é vantajoso para analisar as amostras, por exemplo, dentro do tecido. Outra técnica, a MasSpec Pen^10,foi relatada para atingir alta especificidade e sensibilidade no diagnóstico de câncer de tireoide, mas o diâmetro da sonda está na ordem do mm e é específico para a análise da superfície, o que significa que não pode detectar pequenos nódulos de câncer ou lesões profundamente localizadas. Além disso, como este método usa um canal de fluxo microcapilar embutido na caneta da sonda, a contaminação cruzada deve ser levada em consideração, semelhante ao LDI-MS. Existem outras técnicas que foram aplicadas a configurações clínicas, como a sonda de fluxo e o cotonete^11,mas não são generalizados.

PESI é uma miniaturização extrema do ESI, onde o capilar do nano-eletrospray converge em uma agulha sólida com um raio de curvatura de ponta de várias centenas de nm. A ionização ocorre na área extremamente restrita da ponta da agulha, formando um cone Taylor, no qual as amostras permanecem até que a ionização de todo o fluido na ponta seja concluída¹². Se o analyte ficar na ponta da agulha metálica, o excesso de carga é continuamente gerado na interface entre a agulha metálica e os analytes. Portanto, a ionização sequencial de moléculas ocorre dependendo de sua atividade superficial. Esta propriedade faz da ponta da agulha uma espécie de cromatograma, separando os análites dependendo de sua atividade superficial. Mais tecnicamente, moléculas com a atividade superficial mais forte chegam à superfície do cone Taylor e são ionizadas mais cedo do que aquelas com atividade superficial mais fraca, que aderem à superfície da agulha até o final do processo de ionização. Assim, a ionização completa de todas as moléculas captadas pela agulha é alcançada¹³. Além disso, como essa técnica não envolve a adição de solvente supérfluo à amostra, várias centenas de femtolitros são suficientes para obter espectros de massa fortes o suficiente para análise suplementar¹⁴. Essas propriedades são vantajosas para a análise de amostras biológicas intactas. No entanto, uma grande desvantagem do PESI-MS reside na descontinuidade na ionização devido ao movimento recíproco da agulha ao longo do eixo vertical, semelhante a uma máquina de serrar. A ionização só ocorre quando a ponta da sonda atinge o ponto mais alto quando a altura do orifício do íon está alinhada no eixo horizontal. A ionização cessa enquanto a agulha capta amostras, e assim a estabilidade da ionização não é igual à do ESI convencional. Portanto, pesi-ms não é um método ideal para a proteômica.

Até o momento, o PESI-MS tem sido aplicado principalmente à análise de sistemas biológicos, abrangendo uma ampla gama de campos, desde pesquisas básicas até ambientes clínicos. Por exemplo, a análise direta do tecido humano preparado durante a cirurgia foi capaz de revelar o acúmulo de triacylglicerol tanto no carcinoma celular renal¹⁵ quanto na carcinoma faringeal¹⁶. Este método também pode medir amostras líquidas, como sangue, para se concentrar no perfil lipídico. Por exemplo, algumas moléculas foram delineadas durante mudanças alimentares em coelhos; foi relatado que algumas dessas moléculas diminuíram em estágios muito iniciais dos experimentos, indicando a alta sensibilidade e utilidade deste sistema para diagnóstico clínico¹⁷. Além disso, a aplicação direta a um animal vivo permitiu a detecção de alterações bioquímicas do fígado após apenas uma noite de^{jejum 5}. Zaitsu et al.¹⁸ revisitaram este experimento⁵ e analisaram os perfis metabólicos do fígado quase da mesma forma, com resultados que reforçaram a estabilidade e a reprodutibilidade do nosso método original. Além disso, conseguimos discriminar o tecido cancerígeno do fígado não cancerígeno circundante em camundongos usando esta técnica¹⁹. Portanto, trata-se de uma técnica versátil de espectrometria de massa que é útil em várias configurações, tanto in vivo quanto in vitro. Do outro ponto de vista, o módulo PESI pode ser feito para caber vários espectrômetros de massa, ajustando o acessório de montagem. Neste pequeno artigo, introduzimos o básico e exemplos de aplicações (Figura 1),incluindo aplicações com animais vivos⁵.

De acordo com as normas e leis de cada país, partes desse protocolo precisarão ser revistas para atender aos critérios de cada instituição. A aplicação ao organismo vivo é a mais interessante e desafiadora porque pode fornecer alterações bioquímicas ou metabólicas em tecidos ou órgãos em animais vivos in situ. Embora este pedido tenha sido aprovado pelo comitê institucional de cuidados com animais da Universidade de Yamanashi, em 2013⁵, outra rodada de aprovação agora será necessária devido às recentes mudanças nas regulamentações para os experimentos com animais. Várias modificações no esquema experimental são, portanto, aconselháveis. Em relação ao espectro de massa obtido em experimentos, levando em conta as flutuações de espectros de massa entre cada medida, não há um sistema espectral de compartilhamento de informações que seja comum com a comunidade de sequenciamento de nucleotídeos. Deve-se tomar cuidado quando o operador manuseia a agulha para evitar acidentes com agulhas, especialmente quando a retirada da agulha do suporte da agulha. Um dispositivo especial para desprender a agulha é muito útil para este fim. Como o compartimento do módulo PESI é uma câmara hermética e fechada, o vazamento da pluma de íon não ocorre se o espectrômetro de massa for operado de acordo com as instruções.

Protocol

O comitê institucional de cuidados com animais da Universidade de Yamanashi aprovou todos os protocolos e o uso de animais experimentais aqui declarados. O uso de amostras humanas foi aprovado pelo conselho de ética institucional da Universidade de Yamanashi. 1. Preparação de tecido sólido NOTA: As amostras devem ser mantidas no gelo após sua remoção do animal ou do corpo humano para preservar o frescor do tecido. Se as medidas não seguirem imediatamente a di…

Representative Results

Como retratado na Figura 3,os dados obtidos pela técnica PESI-MS são o espectro de massa, cujo m/z varia de 10 a 1.200 neste sistema. Embora se possa detectar moléculas de até m/z 2.000, houve poucos picos obtidos usando essa técnica ao longo da gama de massas de m/z 1.200. Por isso, analisamos picos de m/z 10 a 1.200. Havia grupos conspícuos de picos em torno de m/z 800 e 900; o primeiro representa component…

Discussion

Embora o PESI seja um derivado do ESI para espectrometria de massa^4,é mais vantajoso para monitorar metabolômicas em tempo real, bem como para analisar reações bioquímicas sem realizar nenhum pré-tratamento complexo ou demorado^5,14,15,17. É uma técnica de espectrometria de massa fácil e instantânea que pode ser aplicada ao estado integrado dos organismos vivos….

Materials

5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU)	Sigma-Aldrich	F8791-25MG	25mg
disposable biposy punch (Trepan)	kai Europa GmbH	BP-30F	bore size 3mm
ethanol	nacalai tesque	14710-25	extra pure reagent
LabSolutions	Shimadzu		ver. 5.96, Data analyzer
micropestle	United Scientific Supplies	S13091
microtube	Treff	982855	0.5 mL clear
PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS)	Shimadzu	DPiMS-2020	Mass spectrometer equipped with PESI
PPGT solition	Shimadzu	ND	Attached to DPiMS-2020