Summary
Presentato qui è un protocollo ottimizzato per isolare, coltivare, tradurre e differenziare i monociti primari umani da individui infettati dall'HIV e dai controlli sani.
Abstract
Il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) rimane una delle principali preoccupazioni per la salute, nonostante l'introduzione della terapia antiretrovirale combinata (cART) a metà degli anni '90. Mentre la terapia antiretrovirale abbassa in modo efficiente il carico virale sistemico e ripristina il normale CD4- conteggi di cellule T, non ricostituisce un sistema immunitario completamente funzionale. Un sistema immunitario disfunzionale in individui infettati da HIV sottoposti a cART può essere caratterizzato da attivazione immunitaria, invecchiamento precoce delle cellule immunitarie o infiammazione persistente. Queste condizioni, insieme ai fattori comorbidi associati all'infezione da HIV, aggiungono complessità alla malattia, che non può essere facilmente riprodotta nei modelli cellulari e animali. Per studiare gli eventi molecolari alla base della disfunzione immunitaria in questi pazienti, viene presentato un sistema per la coltura e la manipolazione dei monociti primari umani in vitro. In particolare, il protocollo consente la coltura e la trasfezione del CD14 primario- monociti ottenuti da individui affetti da HIV sottoposti a cART e da controlli HIV-negativi. Il metodo prevede l'isolamento, la cultura e la trasfezione di monociti e macrofagi derivati da monociti. Mentre sono impiegati kit e reagenti disponibili in commercio, il protocollo fornisce importanti suggerimenti e condizioni ottimizzate per il successo dell'aderenza e della trasfezione dei monociti con mimimi e inibitori di miRNA, nonché con i siRNA.
Introduction
L'infezione da virus immunodeficienza umana-1 (HIV-1) causa una grave disfunzione immunitaria, che può portare a infezioni opportunistiche e sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS). Anche se i pazienti affetti da HIV sottoposti a cART sono caratterizzati da bassi carichi virali e normali conteggi di cellule CD4- T, il funzionamento del sistema immunitario può essere compromesso in questi individui, portando ad una risposta immunitaria disfunzionale che è stata collegata ad un aumento del rischio di sviluppare il cancro1. I meccanismi della disfunzione immunitaria nei pazienti affetti da HIV su cART rimangono in gran parte sconosciuti. Pertanto, caratterizzare le cellule immunitarie derivate dal paziente e studiare la loro biologia e funzione è una componente fondamentale dell'attuale ricerca sull'HIV.
Monociti e macrofagi sono regolatori chiave delle risposte immunitarie e svolgono un ruolo fondamentale nell'infezione da HIV2,3,4,5. Eterogenei e di natura plastica, i macrofagi possono essere ampiamente classificati in attivazione classica (M1) o in alternativa attivati (M2). Mentre questa classificazione generale è necessaria quando si impostano condizioni sperimentali, lo stato di polarizzazione dei macrofagi può essere invertito da una varietà di citochine6,7,8,9. Anche se diversi studi hanno studiato gli effetti dell'infezione da HIV su monociti e cellule dendritiche, i dettagli molecolari delle risposte mediate da monociti sono in gran parte sconosciuti6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Tra i fattori coinvolti nella regolazione e nella funzione delle cellule immunitarie, i microRNA (miRNA), i brevi RNA non codificanti che regolano post-trascrizione l'espressione genica, hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nel contesto delle principali vie cellulari (cioè, crescita, differenziazione, sviluppo e apoptosi)20. Queste molecole sono state descritte come importanti regolatori di fattori di trascrizione essenziali per dettare la polarizzazione funzionale dei macrofagi21. È stato studiato il ruolo potenziale dei miRNA nei monociti di individui affetti da HIV sottoposti a cART, ma i progressi nel campo richiedono molto più lavoro22,23,24,25,26. Questo documento illustra un metodo ottimizzato per trasfect miRNA e siRNA in monociti umani primari da pazienti e controlli infettati da HIV.
Questo protocollo si basa su reagenti e kit disponibili in commercio, poiché la continuità nella procedura tecnica consente di eliminare le variabili sperimentali non necessarie quando si lavora con campioni clinici. Ciò nonostante, il metodo fornisce suggerimenti importanti (cioè il numero di cellule placcate o una breve incubazione con supporti senza siero per promuovere l'aderenza delle cellule alla piastra). Inoltre, le condizioni di polarizzazione utilizzate in questo protocollo derivano dal lavoro pubblicato27,28,29.
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Protocol
Tutti i metodi descritti di seguito sono stati approvati dal Louisiana State University Health Sciences Center New Orleans Institutional Review Board. Tutto il sangue è stato raccolto dopo aver ottenuto il consenso informato.
NOTA: L'intera procedura viene eseguita in condizioni sterili in un impianto di biosicurezza di livello 2 (BSL2) in modo che venga utilizzata cautela per la gestione di materiali biologici. In particolare, ogni passo viene eseguita utilizzando tecniche sterili sotto un armadietto di biosicurezza. Dopo ogni fase che coinvolge sangue, prodotti sanguigni, cellule o pipettaggio di prodotti cellulari, è importante sciacquare tutto il materiale plastico (ad esempio, pipette sierologiche, punte pipette e tubi) con 10% di candeggina da un contenitore di rifiuti all'interno del cofano prima di un corretto smaltimento.
1. Isolamento dei monociti umani primari mediante selezione negativa immunomagnetica
- Raccogli 40 mL di sangue intero fresco e umano (da unpaziente o da un controllo sano) da 10 mL in tubi a vuoto da 10 mL di acido etilenediaminetracetraacetica (EDTA) (10 mL di sangue per tubo). Utilizzando tecniche sterili sotto un armadietto di biosicurezza, trasferire tutti i 40 mL di sangue in un tubo di propilene conico da 50 mL.
- Seguendo il protocollo del produttore per il kit di isolamento monocite umano selezionato (Tabella dei materiali), aggiungere 2 mL di cocktail di isolamento monocito, fornito nel kit, al tubo di sangue. Perline magnetiche vortice, fornite anche nel kit, per 30 s, e aggiungere 2 mL al tubo di sangue.
- Se sono disponibili meno di 40 mL di sangue, ridurre i reagenti aggiunti. Per mescolare la soluzione, pipetta su e giù con una pipetta sierologica da 25 mL di plastica e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Separare equamente la miscela di sangue in quattro tubi da 50 mL e aggiungere 30 mL di salina sterile con buffer di fosfato (PBS) contenente 1 mM EDTA per ciascun tubo. Mescolare pipettando su e giù con una pipetta sierologica da 25 mL di plastica.
- Mettere i tubi in supporti magneti per 10 min per rimuovere le perline magnetiche coniugate anticorpo. Utilizzare quattro supporti magneti contemporaneamente, uno per ogni tubo, per consentire tempi di incubazione e isolamento costanti per ogni campione di sangue.
- Disegnare il contenuto dal centro di ogni tubo, utilizzando una pipetta, mentre sono ancora nei supporti magnete. Fare attenzione a non redigere i globuli rossi (non più del 10% del volume iniziale 10 mL) e posizionare il contenuto in uno dei quattro nuovi tubi da 50 mL.
- Aggiungete 500 l di perline magnetiche vortiche ad ogni tubo da 50 mL. Pipetta su e giù con una pipetta da 25 mL e incubare a RT per 5 min. Quindi, posizionare i tubi in supporti magnete per 5 min.
- Trasferire con attenzione il contenuto dal centro di ogni tubo mentre è ancora in supporti magnete in uno dei quattro nuovi tubi da 50 mL. Posizionare direttamente ogni nuovo tubo da 50 mL nei supporti del magnete per 5 min.
- Trasferire con attenzione il contenuto dal centro di ogni tubo in uno dei quattro nuovi tubi da 50 mL. Gira tutti i nuovi tubi da 50 mL a 300 x g per 5 min. Aspirate il supernatante e rallvi tutti e quattro i pellet cellulari in un totale di 10 mL di PBS sterile.
- Contare le celle per trypan esclusione blu utilizzando un emocitometro.
NOTA: 8-20 x 106 cellule sono generalmente ottenute da 40 mL di sangue intero.
2. Coltura dei monociti umani primari
- L'utilizzo di un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi, un caldo supporto RPMI 1640 senza siero integrato con l'1% di penicillina-streptomycin (penna/strep) e (pur continuando a utilizzare tecniche sterili sotto un armadietto della biosicurezza) riavvalerà i monociti isolati in questo supporto a una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL.
- Aggiungere 1 mL di celle risospese in ogni pozzetto di un piatto da 6 pozzetto o in un piatto da 35 mm (il numero finale di cellule deve essere 1 x 106 celle /piastra), e mettere in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con 5% di CO2. Attendere 0,5-1,0 h affinché le celle aderiscano.
- Utilizzando un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi, il siero bovino fetale (FBS) inattivato dal calore caldo (HI). Aggiungere 100 l (10% di concentrazione finale) di FBS ad ogni piastra. Aggiungere fattori di crescita alle cellule per promuovere la differenziazione dei macrofafi.
- Primi macrofagi per un fenotipo simile a M1 aggiungendo ai media 25 ng/mL di fattore di stimolazione della colonia di granulociti-macrofagi (GM-CSF). Primi macrofagi per un fenotipo simile a M2 aggiungendo 50 ng/mL di macrofalo fattore stimolante della colonia (M-CSF) ai media28.
NOTA: sia GM-CSF che M-CSF consentono la differenziazione del monocito a un fenotipo generale del macrofago (M0) durante l'innesco delle cellule per M1 o M2, rispettivamente7,28,30.
- Primi macrofagi per un fenotipo simile a M1 aggiungendo ai media 25 ng/mL di fattore di stimolazione della colonia di granulociti-macrofagi (GM-CSF). Primi macrofagi per un fenotipo simile a M2 aggiungendo 50 ng/mL di macrofalo fattore stimolante della colonia (M-CSF) ai media28.
3. Tradurre i monociti umani primari nella cultura
- Monociti transfetti con mimimi miRNA o inibitori o siRNA utilizzando un kit contenente un reagente di trasfezione basato su polimeri (Tabella dei materiali).
- Seguendo il protocollo del produttore per il kit di trasfezione (e continuando l'uso di tecniche sterili sotto un armadietto di biosicurezza), diluire prima i mimi/inibitori o i siRNA selezionati nel buffer fino a una concentrazione finale di 1,83M.
- Preparare il reagente di trasfezione aggiungendo 1 L del polimero fornito a un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml, seguito immediatamente dall'aggiunta di 90 l buffer forniti (per un totale di 91 l di reagente per trasfezione). Vortice per 3-5 s.
- Pipetta 90 L di soluzione di trasfezione nel tubo contenente 10 -L di miRNA diluito mimic/inibitore o siRNA. Mescolare con pipettaggio delicato e incubare per 15 min a RT.
- Aggiungere 100 L di complesso di trasfezione a un pozzo (o piatto) di 1 x 106 monociti placcati. Incubare le cellule per 4 h a 37 , quindi sostituire il supporto con 3 mL di supporti completi (RPMI 1640 integrato con 1% penicillina-streptomicina e 10% di FBS inattivati dal calore) contenenti GM-CSF o M-CSF.
4. Differenziazione e attivazione M1/M2
- I monociti iniziano immediatamente a differenziarsi con ampi macrofagi M0 dopo la placcatura in coltura. Il terzo giorno dopo la placcatura, continuare l'utilizzo di tecniche sterili sotto un armadio di biosicurezza e sostituire i supporti con 3 mL di nuovi supporti RMPI 1640 (completati con 1% penicillina-streptomycin, 10% di FBS inattivati dal calore e 25 ng/mL GM-CSF per promuovere la polarizzazione M1-like o 50 ng/mL M-CSF per promuovere la polarizzazione M2). Coltura le cellule in queste condizioni per un totale di 6 giorni da placcatura iniziale in un'incubatrice a 37 c, 5% CO2.
- Per far avanzare la polarizzazione delle cellule innescate al fenotipo M1-macrophage, attivare le cellule il giorno 6 dell'incubazione sostituendo i supporti cellulari con un nuovo supporto contenente il 5% di FBS disattivazione del calore, l'1% di penna/strep, 100 lipopolysaccharide derivati da ng/mL E. coli(LPS) e gamma di interfero 20 ng/mL (IFN-).
- Per far avanzare la polarizzazione delle cellule innescate al fenotipo M2-macrophage, attivare le cellule il giorno 6 dell'incubazione sostituendo i supporti cellulari con nuovi supporti contenenti il 5% di FBS disturbati dal calore, 1% penna/strep, 10 ng/mL M-CSF e 20 interleuin 4 ng/mL (IL-4).
- Dopo 24 h, raccogliere le cellule per l'RNA, proteine, o analisi della citometria di flusso.
- Quando le cellule sono pronte per la raccolta, lavare le cellule nel piatto 2x con PBS (a RT per l'estrazione dell'RNA o raffreddate sul ghiaccio per l'estrazione di proteine). Poiché i macrofagi differenziati sono ora saldamente attaccati alle piastre, lesizie delle cellule nelle piastre direttamente per ottenere materiale per le analisi dell'RNA e delle proteine.
- Per la raccolta del materiale per la citometria di flusso, aggiungere PBS contenente 2 mM EDTA al piatto, incubare le cellule per 10 min a 37 gradi centigradi, raschiare delicatamente le cellule dal piatto e raccogliere il contenuto in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL prima di procedere con protocolli standard.
5. Citometria di flusso
- Risciacquare le cellule in PBS per rimuovere il mezzo di coltura. Abbassare 100.000 cellule (per ogni condizione di citometria di flusso) e sospendere nuovamente il pellet in 100 - L di PBS contenente 2 -L di inibitore del legame HuFcR. Incubare a RT per 15 min.
- Aggiungere 50 l di tampone di colorazione e gli anticorpi desiderati (qui, CD80, CD83, CD163 e CD209) nelle quantità raccomandate.
- Mescolare delicatamente e incubare a 4 gradi centigradi al buio per 30 min.
- Lavare 2x con PBS e risospendere le celle macchiate in 150 gradi l di PBS prima di eseguire il campione su un citofluorimetro.
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Representative Results
Utilizzando la procedura descritta, sono stati isolati i monociti umani primari di individui affetti da HIV e donatori sani. Tutti i dati qui presentati sono stati ottenuti daHIV: soggetti sottoposti a cART con basso (<20 copie/mL) o carichi virali non rilevabili e normali conteggi di cellule CD4e T. Subito dopo l'isolamento, le cellule sono state macchiate, e la citometria di flusso è stata eseguita per confermare la purezza delle popolazioni di cellule. I risultati hanno mostrato che >97% delle cellule macchiate positive per CD14 (dati non mostrati). Per la polarizzazione dei macrofagi, è stato utilizzato un protocollo pubblicato28. I monociti umani primari sono stati coltivati in presenza di GM-CSF o M-CSF per 6 giorni. Il sesto giorno, le cellule sono state attivate verso i macrofagi M1 o M2. Ventiquattro ore dopo l'attivazione, le cellule sono state raccolte e macchiate per l'analisi della citometria di flusso dei marcatori delle cellule macrofaci.
La figura 1 mostra istogrammi rappresentativi di celle attivate da M1 di controllo (( Figura 1A) e derivate dal paziente (Figura 1B) con livelli aumentati di CD80 e CD83 e livelli di diminuzione di CD163 rispetto alle celle T0 non attivate, nonché cellule attivate da M2 con livelli aumentati di CD163 e CD209. Il pannello C mostra l'espressione di CD80, CD83, CD163 e CD209 nelle cellule polarizzate M1 e M2. Il grafico rappresenta i dati medi ottenuti da tre set di cellule derivate dall'HIV e dal controllo e tre. Come previsto, i livelli di espressione di CD80 e CD83 sono aumentati in M1 rispetto alle cellule polarizzate M2, mentre CD209 e CD163 erano più altamente espressi in M2 rispetto alle cellule polarizzate M1. È interessante notare che CD80 e CD83 sembravano essere più altamente espressi nelle cellule derivate dal controllo rispetto alle cellule derivate dall'HIV. Tuttavia, potenziali differenze nella capacità di polarizzare e/o i livelli di espressione dei marcatori di polarizzazione nelle cellule derivate dall'HIV rispetto ai controlli richiede ulteriori indagini. Anche se gm-CSF, M-CSF, LPS, e IFN-z sono stati scelti come trattamenti, altre combinazioni di fattori di crescita, citochine, o stimolatori possono essere utilizzati con questo protocollo28.
Dopo che gli esperimenti preliminari hanno dimostrato che la procedura di isolamento ha avuto successo, i monociti appena raccolti sono stati placcati in 6 placche di pozzo e trasfettati con un miRNA strapazzato, etichettato vicino all'infrarosso, per determinare l'efficienza della trasfezione. Le cellule sono state immagini 24 h post-trasfezione mediante microscopia confocale fluorescente. Con questo metodo, è stata ottenuta l'efficienza >90% della trasfezione, come determinato dalla citometria di flusso (Figura 2A) e dalla microscopia confocale (Figura 2B).
Successivamente, è stata determinata la vitalità delle cellule dopo la trasfezione. La figura 3 mostra la fattibilità delle cellule, determinata utilizzando un'espressione colorimetrica come media di cellule derivate da due pazienti (Figura 3A) e due controlli ( Figura3B) trascate al giorno 1 (Figura 3A) o giorno 4 (Figura 3B) e raccolte al giorno 7. Per questo esperimento, 50.000 cellule sono state placcate su una piastra multi-pozzetto 96 e trafettate seguendo il protocollo. In generale, la trasfezione non ha ridotto significativamente la vitalità delle cellule, indipendentemente dallo stadio di maturazione delle cellule e dalle condizioni di trasfezione (ad esempio, mock, siRNA/miRNA strapazzate o siRNA/miRNA). Va notato che la figura 3 rappresenta i dati ottenuti dalle cellule derivate dal paziente (pannello A) e dalle cellule derivate dal controllo (pannello B). Ciò era necessario, poiché non erano sufficienti cellule per eseguire l'esperimento completo (sia la vitalità che la macchia occidentale per le trafettazioni del primo e del giorno 4, in sei diverse condizioni per trasfezione) con un singolo campione erano in grado di essere ottenute. Tuttavia, la cifra fornisce risultati rappresentativi ottenibili con cellule di controllo o derivate dal paziente.
Quindi, l'efficacia della trafezione del siRNA sull'mRNA bersaglio è stata valutata valutando l'espressione proteica. I risultati nella Figura 4 mostrano un'efficace downregolazione di EIF4EBP1, un regolatore traslazionale altamente abbondante in queste cellule, dopo la trasfezione con un siRNA specifico sia al giorno 1(Figura 4A) che al quarto giorno (Figura 4). Lo stesso regolatore ha inoltre mantenuto l'espressione nelle varie condizioni di controllo (ad esempio, non trascurati, finti, siRNA strapazzati e siRNA EIF4EBP1 senza reagente di trasfezione: siR). La quantificazione degli esperimenti western blot per la trasfezione del giorno 1 e del giorno 4 è illustrata rispettivamente nella Figura 4B e nella Figura 4D. Inoltre, sono stati determinati i livelli di espressione di miR-146a-5p dopo la trasfezione al primo o al giorno 4 da RT-qPCR di cellule derivate dall'HIV (Figura 4E). Le cellule trastagite da miRNA mimiche hanno mostrato un aumento da 48 a 72 volte dell'espressione di miRNA su cellule non trastrancate, mentre tutti i controlli della trasfezione non mostrano cambiamenti apprezzabili.
Figura 1: I macrofagi derivati da monociti vengono polarizzati e attivati con successo verso i fenotipi dei macrofagi M1 o M2. I risultati dell'analisi della citometria di flusso delle cellule derivate da un controllo sano (A) e un campione di cellule derivate dall'HIV (B) mostrano i livelli di CD80, CD83, CD163 e CD209. L'esperimento è stato ripetuto con due controlli aggiuntivi e due campioni sieropositivi aggiuntivi con risultati simili. La popolazione cellulare di interesse è stata sbilanciata sulla base di parametri di dispersione in avanti e laterale, seguiti da discriminazione di doppietta. (C) Grafico a barre che mostra le cellule polarizzate CD80, CD83, CD163 e CD209 nelle cellule polarizzate M1 e M2. Il grafico rappresenta i dati medi e le deviazioni standard ottenuti da tre set di celle derivate dall'HIV (Pts). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: CD14 umanoprimario: le cellule vengono trascinate in modo efficiente con i miRNA. (A) Analisi della citometria di flusso dei monociti primari derivati da controlli sani, 24 ore dopo la trasfezione, mostrando >90% efficienza di trasfezione. (B) L'immagine confocale rappresentativa scattata 24 h dopo la trasfezione mostra che tutte le cellule sul campo esprimono il miRNA coniugato con un colorante vicino all'infrarosso (in bianco). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Vitalità delle cellule trasfette. Le barre del grafico rappresentano la vitalità cellulare media di duepazienti HIV (A) e due controlli sani (B) determinati utilizzando un test colorimetrico, dopo la trasfezione con miR-146a-5p o siRNA a EIF4EBP1 (siRNA) e i controlli appropriati al giorno 1 (A) o al giorno 4 (B), tutti testati al giorno 7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Deformazione efficiente dei livelli proteici in caso di transitoriazione di siRNA/miRNA dopo l'isolamento di CD14e monociti. I monociti di controllo e di derivazione dell'HIV (1 x 106 cellule) sono stati transinfettati al giorno 1 (A) o al giorno 4 (C) dopo l'isolamento utilizzando il siRNA contro l'mRNA EIF4EBP1. I gruppi di pannelli (B) e (D) rappresentano la quantificazione dell'espressione EIF4EBP1 rispetto a GAPDH ed è espressa come percentuale rispetto a mock per paziente (Pt) o controllo (Ctrl) (A) o non transinfettato per paziente o controllo (B). (E) Grafico a barre rappresentative di due esperimenti che mostrano l'espressione miR-146a-5p nelle cellule derivate dall'HIV trasfetate al giorno 4 (barre 1-4) o al giorno 1 (barra destra) e raccolte al giorno 7. La variazione di piegatura viene calcolata sul campione non trascurato (siR e siRNA). indicano l'incubazione delle cellule con siRNA o miR-146a-5p senza la reagente di trasfezione. L'esperimento è stato ripetuto 2 volte con cellule derivate dal controllo e ha prodotto essenzialmente gli stessi risultati (dati non mostrati). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo presentato dimostra l'uso di cellule primarie di soggetti infettati da HIV come modello per studiare monociti e macrofagi. HIV- I pazienti sottoposti a cART vivono con infezione per più anni e possono anche avere altre co-infezioni correlate a un sistema immunitario compromesso. Per studiare l'immunomodulazione in presenza di infezione cronica da HIV, le cellule sono state raccolte direttamente dai pazienti. Poiché i miRNA hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nello sviluppo cellulare e nella differenziazione, il protocollo si concentra sulla capacità di manipolare l'espressione miRNA in queste cellule primarie (Figura 2, Figura 3, Figura 4). Utilizzando la stessa procedura, questo protocollo funziona molto bene anche per i siRNA (Figura 3, Figura 4). A causa della potenziale attività fagocitatica dei macrofagi maturi, oltre ai controlli siRNA simulati e scramble, viene utilizzato un controllo (indicato come siR o miR nella Figura 3 e Figura 4), in cui il reagente di trasfezione viene omesso. I dati confermano che il reagente di trasfezione è necessario per una corretta somministrazione di siRNA/miRNA nelle cellule, poiché senza il reagente, le cellule non assumono spontaneamente il miRNA o il siRNA, anche quando sono già differenziate in macrofagi (giorno 4 dopo placcatura e polarizzazione, Figura 3 e Figura 4).
Durante l'utilizzo di kit disponibili in commercio per l'isolamento e la trasfezione dei monociti primari umani CD14- monociti, ci sono passaggi chiave ottimizzati per rendere la procedura riproducibile e di successo. In particolare, 1) il numero di cellule placcate è fondamentale per la loro sopravvivenza e differenziazione, e 1 x 106 cellule / 35 mm piatto è stato trovato per funzionare meglio. 2) CD14 appena isolate: le cellule non si attaccano uniformemente al piatto di coltura se seminato in presenza di FBS. Di conseguenza, quando si sostituisce il mezzo di 4 h dopo la trasfezione, tutte le cellule non attaccate saranno rimosse, rendendo le condizioni piastra-piastra altamente variabili. 3) Si è scoperto che la sostituzione del mezzo di 4 ore dopo la trasfezione, riduce la tossicità dovuta alla trasfecazione dei reagenti senza influire sull'efficienza della trasfezione. 4) Le condizioni di trasfezione sono state ottimizzate per richiedere meno siRNA o miRNA (15 nM) rispetto alle concentrazioni raccomandate dal produttore (25 nM). 5) A causa della natura altamente aderente delle cellule, l'aggiunta di tampone di lisi direttamente alla piastra migliora notevolmente la concentrazione di proteine o RNA raccolto. Tuttavia, se è necessario rimuovere le cellule dalla piastra (cioè, per l'analisi della citometria del flusso), è meglio usare PBS con EDTA e raschiare delicatamente le cellule. Questo metodo riduce il numero di cellule raccolte di circa il 20%-30%, quindi è importante pianificare gli esperimenti di conseguenza per ottenere numeri di cella sufficienti per ulteriori analisi.
Se seguita correttamente, questa procedura dimostra l'ottenimento di CD14 altamente puro: popolazione di monociti, trasfezione di siRNA e piccoli RNA come miRNA, condizioni di coltura e differenziazione in macrofagi M1 o M2. Questo metodo può essere applicato per studiare malattie complesse o infezioni diverse dall'HIV.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il nucleo del biorepository clinico/tumorale dell'HIV per aver fornito campioni di pazienti e il nucleo del metabolismo dell'immunologia cellulare per la fornitura dell'analisi della citometria del flusso. Questo progetto è stato finanziato da NIH P20GM121288 e P30GM114732.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
References
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