Summary
Présenté ici est un protocole optimisé pour isoler, cultiver, transfecter, et différencier les monocytes primaires humains des individus infectés par le VIH et des contrôles sains.
Abstract
Le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) demeure un problème de santé majeur malgré l'introduction d'un traitement antirétroviral combiné (coART) au milieu des années 1990. Bien que la thérapie antirétrovirale abaisse efficacement la charge virale systémique et rétablisse le nombre normal de cD4et de lymphocytes T, elle ne reconstitue pas un système immunitaire complètement fonctionnel. Un système immunitaire dysfonctionnel chez les personnes infectées par le VIH subissant une multithérapie peut être caractérisé par une activation immunitaire, un vieillissement précoce des cellules immunitaires ou une inflammation persistante. Ces conditions, ainsi que les facteurs comorbides associés à l'infection par le VIH, ajoutent de la complexité à la maladie, qui ne peut pas être facilement reproduite dans les modèles cellulaires et animaux. Pour étudier les événements moléculaires sous-jacents au dysfonctionnement immunitaire dans ces patients, un système à la culture et manipuler les monocytes primaires humains in vitro est présenté ici. Plus précisément, le protocole permet la culture et la transfection des monocytes CD14 primaires obtenus auprès de personnes infectées par le VIH qui subissent une multithérapie ainsi que de contrôles séronégatifs. La méthode implique l'isolement, la culture et la transfection des monocytes et des macrophages dérivés de monocytes. Tandis que des kits et des réactifs disponibles dans le commerce sont employés, le protocole fournit des bouts importants et des conditions optimisées pour l'adhérence réussie et la transfection des monocytes avec des imitations et des inhibiteurs de miRNA aussi bien qu'avec des siRNAs.
Introduction
L'infection par le virus de l'immunodéficience humaine 1 (VIH-1) provoque un dysfonctionnement immunitaire grave, qui peut entraîner des infections opportunistes et le syndrome d'immunodéficience acquise (sida). Bien que les patients infectés par le VIH qui subissent une multithérapie soient caractérisés par de faibles charges virales et des numérations normales de CD4et de lymphocytes T, le fonctionnement du système immunitaire peut être compromis chez ces personnes, ce qui entraîne une réponse immunitaire dysfonctionnelle qui a été associée à un risque accru de développer un cancer1. Les mécanismes de dysfonctionnement immunitaire chez les patients séropositifs sous la cothérapie demeurent largement inconnus. Par conséquent, caractériser les cellules immunitaires d'origine du patient et étudier leur biologie et leur fonction est un élément essentiel de la recherche actuelle sur le VIH.
Les monocytes et les macrophages sont des régulateurs clés des réponses immunitaires et jouent un rôle fondamental dans l'infection par le VIH2,3,4,5. Hétérogènes et plastiques de nature, les macrophages peuvent être largement classés en activéclassiquement (M1) ou alternativement activés (M2). Bien que cette classification générale soit nécessaire lors de la mise en place de conditions expérimentales, le statut de polarisation des macrophages peut être inversé par une variété de cytokines6,7,8,9. Bien que plusieurs études aient étudié les effets de l'infection par le VIH sur les monocytes et les cellules dendritiques, les détails moléculaires des réponses monocytes-négociées sont en grande partie inconnus6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Parmi les facteurs impliqués dans la régulation et la fonction des cellules immunitaires, il a été démontré que les microARN (miARN) courts et non codants qui régulent l'expression des gènes après la transcription, jouent un rôle important dans le contexte des principales voies cellulaires (c.-à-d. la croissance, la différenciation, le développement et l'apoptose)20. Ces molécules ont été décrites comme d'importants régulateurs de facteurs de transcription essentiels pour dicter la polarisation fonctionnelle des macrophages21. Le rôle potentiel des miARN dans les monocytes des personnes infectées par le VIH subissant une multithérapie a été étudié, mais les progrès dans le domaine exigent beaucoup plus de travail22,23,24,25,26. Cet article traite d'une méthode optimisée pour transfect miRNAs et siRNAs dans les monocytes humains primaires des patients et des contrôles HIV-infectés.
Ce protocole repose sur des réactifs et des kits disponibles dans le commerce, car la continuité de la procédure technique permet d'éliminer les variables expérimentales inutiles lorsqu'on travaille avec des échantillons cliniques. Néanmoins, la méthode fournit des conseils importants (c.-à-d., le nombre de cellules plaquées ou une brève incubation avec des médias sans sérum pour favoriser l'adhérence des cellules à la plaque). En outre, les conditions de polarisation utilisées dans ce protocole sont dérivées de l'ouvrage publié27,28,29.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ci-dessous ont été approuvées par le Louisiana State University Health Sciences Center New Orleans Institutional Review Board. Tout le sang a été recueilli après avoir obtenu le consentement éclairé.
REMARQUE : L'ensemble de la procédure est effectué dans des conditions stériles dans une installation de biosécurité de niveau 2 (BSL2) afin que la prudence soit utilisée pour manipuler les matériaux biologiques. En particulier, chaque étape est effectuée à l'aide de techniques stériles sous un cabinet de biosécurité. Après chaque étape impliquant le sang, les produits sanguins, les cellules, ou le pipetage de produit de cellules, il est important de rincer tous les matériaux en plastique (c.-à-d., pipettes sérologiques, bouts de pipette, et tubes) avec 10% d'eau de Javel d'un récipient de rectification à l'intérieur du capot avant l'élimination appropriée.
1. Isolement des monocytes humains primaires par sélection négative immunomagnétique
- Recueillir 40 ml de sang entier frais (à partir d'unpatient séropositif ou d'un contrôle sain) dans quatre tubes à vide de 10 ml d'acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA) (10 mL de sang par tube). À l'aide de techniques stériles sous un cabinet de biosécurité, transférer les 40 ml de sang dans un tube de propylène conique de 50 ml.
- Suivant le protocole du fabricant pour le kit d'isolement des monocytes humains sélectionnés (Table of Materials), ajoutez 2 ml de cocktail d'isolation monocyte, fourni dans le kit, au tube de sang. Perles magnétiques Vortex, également fournies dans le kit, pour 30 s, et ajouter 2 ml au tube de sang.
- Si moins de 40 ml de sang sont disponibles, réduire les réactifs ajoutés. Pour mélanger la solution, pipette de haut en bas avec une pipette sérologique en plastique de 25 ml et incuber pendant 5 min à température ambiante (RT).
- Séparer le mélange sanguin également en quatre tubes de 50 ml et ajouter 30 ml de salline stérile tamponnée par phosphate (PBS) contenant 1 mM EDTA à chaque tube. Mélanger en pipetting de haut en bas avec une pipette sérologique en plastique de 25 ml.
- Placez les tubes dans des supports d'aimant pendant 10 min pour enlever les perles magnétiques conjuguées par anticorps. Utilisez quatre supports d'aimant simultanément, un pour chaque tube, pour permettre des temps d'incubation et d'isolement constants pour chaque échantillon de sang.
- Dessinez le contenu à partir du centre de chaque tube, à l'aide d'une pipette, alors qu'ils sont encore dans les supports d'aimant. Veillez à ne pas dresser les globules rouges (pas plus de 10 % du volume de départ de 10 ml) et placez le contenu dans l'un des quatre nouveaux tubes de 50 ml.
- Ajouter 500 l de perles magnétiques vortexées à chaque tube de 50 ml. Pipette de haut en bas avec une pipette de 25 ml et incuber à RT pendant 5 min. Ensuite, placez les tubes dans des supports d'aimant pendant 5 min.
- Transférer soigneusement le contenu du centre de chaque tube tout en conservant des supports d'aimant dans l'un des quatre nouveaux tubes de 50 ml. Placez directement chaque nouveau tube de 50 ml dans les supports d'aimant pendant 5 min.
- Transférer soigneusement le contenu du centre de chaque tube dans l'un des quatre nouveaux tubes de 50 ml. Faites tourner tous les nouveaux tubes de 50 ml à 300 x g pendant 5 min. Aspirez le supernatant et suspendez les quatre granulés de cellules dans un total de 10 ml de PBS stérile.
- Comptez les cellules par exclusion bleue trypan à l'aide d'un hémocytomètre.
REMARQUE : 8-20 x 106 cellules sont généralement obtenues à partir de 40 ml de sang entier.
2. Cultiver des monocytes humains primaires
- À l'aide d'un bain d'eau de 37 oC, le préfère RPMI 1640 sans sérum chaud est complété par 1 % de pénicilline-streptomycine (pen/streptocoque) et (tout en continuant d'utiliser des techniques stériles dans le cadre d'un cabinet de biosécurité) à suspendre les monocytes isolés dans ce milieu à une concentration de 1 x 106 cellules/mL.
- Ajouter 1 ml de cellules en suspension à chaque puits d'une plaque de 6 puits ou dans un plat de 35 mm (le nombre final de cellules doit être de 1 x 106 cellules/plaque), et placer dans un incubateur de 37 oC avec 5 % de CO2. Attendez 0.5-1.0 h pour que les cellules adhèrent.
- À l'aide d'un bain d'eau à 37 oC, sérum bovin fœtal (SF) à inactivé par la chaleur chaude (SF). Ajouter 100 l (10 % de concentration finale) de FBS à chaque assiette. Ajouter des facteurs de croissance aux cellules pour favoriser la différenciation des macrophages.
- Macrophages de premier choix pour un phénotype de type M1 en ajoutant 25 ng/mL de facteur de stimulation de la colonie granulocyte-macrophage (GM-CSF) aux médias. Macrophages de premier choix pour un phénotype de type M2 en ajoutant 50 ng/mL de facteur de stimulation de la colonie de macrophages (M-CSF) aux médias28.
REMARQUE : Les deux GM-CSF et M-CSF permettent la différenciation de monocyte à un phénotype de macrophage général (M0) tout en amorçant des cellules pour M1 ou M2, respectivement7,28,30.
- Macrophages de premier choix pour un phénotype de type M1 en ajoutant 25 ng/mL de facteur de stimulation de la colonie granulocyte-macrophage (GM-CSF) aux médias. Macrophages de premier choix pour un phénotype de type M2 en ajoutant 50 ng/mL de facteur de stimulation de la colonie de macrophages (M-CSF) aux médias28.
3. Transfecting monocytes humains primaires dans la culture
- Monocytes transfect avec miRNA imite ou inhibiteurs ou siRNA à l'aide d'un kit contenant un réactif de transfection à base de polymère (Tableau des matériaux).
- Suivant le protocole du fabricant pour le kit de transfection (et la poursuite de l'utilisation de techniques stériles sous un cabinet de biosécurité), diluer d'abord les miRNA sélectionnés imite/inhibiteurs ou siRNAs dans le tampon à une concentration finale de 1,83 M. Préparer 10 'L d'imitation diluée / inhibiteur par transfection de 1 x 106 cellules.
- Préparer le réactif de transfection en ajoutant 1 ll du polymère fourni à un tube microcentrifuge frais de 1,5 mL, suivi immédiatement par l'ajout de 90 l de tampon fourni (pour un total de 91 l de réactif par transfection). Vortex pour 3-5 s.
- Pipette 90 l de solution de transfection dans le tube contenant 10 l d'imitation/inhibiteur ou siRNA dilué de miRNA. Mélanger par pipetting douce et couver pendant 15 min à RT.
- Ajouter 100 l de complexe de transfection à un puits (ou plat) de 1 x 106 monocytes plaqués. Incuber les cellules pendant 4 h à 37 oC, puis remplacer le milieu par 3 ml de milieu xfpf (RPMI 1640 complété par 1 % de pénicilline-streptomycine et 10 % de FBS inactivé par la chaleur) contenant soit GM-CSF, soit M-CSF.
4. Différenciation et activation M1/M2
- Les monocytes commencent immédiatement à se différencier des macrophages M0 larges sur le placage dans la culture. Le troisième jour après le placage, continuer à utiliser des techniques stériles sous un cabinet de biosécurité et remplacer les médias par 3 ml de nouveaux médias RMPI 1640 (complété s'ajouter à 1% de pénicilline-streptomycine, 10% de FBS inactivé par la chaleur, et soit 25 ng/mL GM-CSF pour promouvoir la polarisation M1-like ou 50 ng/mL M-CSF pour promouvoir M2-as. Culture des cellules dans ces conditions pour un total de 6 jours à partir du placage initial dans un incubateur à 37 oC, 5% CO2.
- Pour faire progresser la polarisation des cellules apprêtées au phénotype M1-macrophage, activez les cellules le jour 6 de l'incubation en remplaçant les médias cellulaires par de nouveaux supports contenant 5 % de FBS inactivé par la chaleur, 1 % de stylo/streptocoque, 100 ng/mL E. colidérivé du lipopolysaccharide (LPS) et 20 ng/mL d'interféron gamma (IFN- ).
- Pour faire progresser la polarisation des cellules apprêtées au phénotype M2-macrophage, activez les cellules le jour 6 de l'incubation en remplaçant les médias cellulaires par de nouveaux supports contenant 5 % de FBS inactivé par la chaleur, 1 % de stylo/streptocoque, 10 ng/mL M-CSF et 20 ng/mL d'interleukine 4 (IL-4).
- Après 24 h, récoltez les cellules pour les analyses d'ARN, de protéine ou de cytométrie d'écoulement.
- Lorsque les cellules sont prêtes à être rectifiées, lavez les cellules dans le plat 2x avec PBS (à RT pour l'extraction de l'ARN ou refroidies sur la glace pour l'extraction des protéines). Parce que les macrophages différenciés sont maintenant fermement attachés aux plaques, lyser les cellules dans les plaques directement pour obtenir du matériel pour les analyses d'ARN et de protéines.
- Pour la collecte du matériel pour la cytométrie d'écoulement, ajouter le PBS contenant 2 mM EDTA au plat, incuber les cellules pendant 10 min à 37 oC, gratter doucement les cellules du plat, et recueillir le contenu dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml avant de procéder avec les protocoles standard.
5. Cytométrie de flux
- Rincer les cellules dans PBS pour enlever le milieu de culture. Faites baisser 100 000 cellules (par état de cytométrie d'écoulement) et suspendez à nouveau la pastille dans 100 L de PBS contenant 2 l d'inhibiteur de liaison HuFcR. Incuber à RT pendant 15 min.
- Ajoutez 50 ll de tampon de coloration et les anticorps désirés (ici, CD80, CD83, CD163 et CD209 ont été utilisés) dans les quantités recommandées.
- Mélanger délicatement et incuber à 4 oC dans l'obscurité pendant 30 min.
- Laver 2x avec du PBS et resuspendre les cellules tachées dans 150 OL de PBS avant d'exécuter l'échantillon sur un cytofluorimètre.
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Representative Results
À l'aide de la procédure décrite, les monocytes humains primaires provenant de personnes infectées par le VIH et de donneurs en bonne santé ont été isolés. Toutes les données présentées ici ont été obtenues à partir desujets séropositifs et soumis à une multithérapie avec des charges virales faibles (lt;20 copies/mL) ou indétectables et des numérations normales de CD4et de lymphocytes T. Immédiatement après l'isolement, les cellules ont été souillées, et la cytométrie de flux a été exécutée pour confirmer la pureté des populations cellulaires. Les résultats ont montré que les cellules tachées de 97 % étaient positives pour le CD14 (données non présentées). Pour la polarisation des macrophages, un protocole publié a été utilisé28. Les monocytes humains primaires ont été cultivés en présence de GM-CSF ou DeF pendant 6 jours. Le sixième jour, les cellules ont été activées vers les macrophages M1 ou M2. Vingt-quatre heures après l'activation, des cellules ont été moissonnées et souillées pour l'analyse de cytométrie d'écoulement des marqueurs de cellules de macrophage.
La figure 1 montre les histogrammes représentatifs des cellules témoins activées par M1 (figure 1A) et des cellules dérivées du patient (figure 1B) avec des niveaux accrus de CD80 et de CD83 et des niveaux diminués de CD163 par rapport aux cellules T0 non activées, ainsi que des cellules activées par M2 avec des niveaux accrus de CD163 et de CD209. Le panneau C montre l'expression des cellules polarisées CD80, CD83, CD163 et CD209 dans les cellules polarisées M1 et M2. Le graphique représente les données moyennes obtenues à partir de trois ensembles de cellules dérivées du VIH et de trois ensembles de cellules dérivées du VIH. Comme prévu, les niveaux d'expression de CD80 et CD83 ont augmenté en M1 par rapport aux cellules polarisées M2, tandis que les CD209 et CD163 ont été plus fortement exprimés en M2 par rapport aux cellules polarisées M1. Fait intéressant, les CD80 et CD83 semblaient être plus fortement exprimés dans les cellules dérivées du contrôle que dans les cellules dérivées du VIH. Cependant, les différences potentielles dans la capacité de polariser et/ou les niveaux d'expression des marqueurs de polarisation dans les cellules dérivées du VIH par rapport aux témoins nécessitent une étude plus approfondie. Bien que GM-CSF, M-CSF, LPS, et IFN-MD aient été choisis comme traitements, d'autres combinaisons de facteurs de croissance, de cytokines ou de stimulateurs peuvent être utilisées avec ce protocole28.
Après des expériences préliminaires ont prouvé que la procédure d'isolement a été réussie, les monocytes fraîchement rassemblés ont été plaqués dans 6 plaques de puits et transfected avec un miRNA brouillé, proche-infrarouge-étiqueté pour déterminer l'efficacité de transfection. Des cellules ont été imaged 24 h post-transfection par microscopie confocalfluorescente. Avec cette méthode, l'efficacité de la transfection a été atteinte de 90 %, comme en témoigne la cytométrie du débit (figure 2A) et la microscopie confocale (Figure 2B).
Ensuite, la viabilité des cellules après la transfection a été déterminée. La figure 3 montre la viabilité des cellules, déterminées à l'aide d'un résultat colorimétrique comme moyenne des cellules dérivées de deux patients (figure 3A) et de deux témoins ( figure3B) transfectés au jour 1 (figure 3A) ou au jour 4 (figure 3B) et récoltés au jour 7. Pour cette expérience, 50 000 cellules ont été plaquées sur une plaque multi-puits 96 et transfectées selon le protocole. En général, la transfection n'a pas réduit de façon significative la viabilité des cellules, quel que soit le stade de maturation des cellules et les conditions de transfection (c.-à-d. siRNA/miRNA simulés et brouillés ou siRNA/miRNA). Il convient de noter que la figure 3 représente les données obtenues à partir de cellules dérivées du patient (panel A) et de cellules dérivées du contrôle (panneau B). Cela était nécessaire, car pas assez de cellules pour effectuer l'expérience complète (à la fois la viabilité et la tache occidentale pour les transfections de jour 1 et jour 4, dans six conditions différentes par transfection) avec un seul échantillon ont pu être obtenus. Néanmoins, le chiffre fournit des résultats représentatifs obtenus avec des cellules témoins ou dérivées du patient.
Ensuite, l'efficacité de la transfection de siRNA sur l'ARNm cible a été évaluée en évaluant l'expression de protéine. Les résultats de la figure 4 montrent une régulation efficace de l'EIF4EBP1, un régulateur translationnel très abondant dans ces cellules, lors de la transfection avec un siRNA spécifique au jour 1 ( figure4A) et au jour 4 (Figure 4C). Le même régulateur a également maintenu l'expression dans les différentes conditions de contrôle (c.-à-d., non transfected, mock, siRNA brouillé, et EIF4EBP1 siRNA sans réactif de transfection : siRMD). La quantification des expériences de blot de l'Ouest pour la transfection des jours 1 et 4 est présentée dans la figure 4B et la figure 4D,respectivement. De plus, les niveaux d'expression de miR-146a-5p après la transfection au jour 1 ou au jour 4 par RT-qPCR des cellules dérivées du VIH ont été déterminés (figure 4E). Les cellules transfectées avec l'imitation de miRNA ont montré une augmentation de 48 à 72 fois de l'expression de miRNA au-dessus des cellules non transfected, alors que tous les contrôles de transfection ne montrent aucun changement appréciable.
Figure 1 : Les macrophages dérivés du monocyte sont polarisés et activés avec succès vers les phénotypes macrophages M1 ou M2. Les résultats de l'analyse de cytométrie des flux des cellules dérivées d'un contrôle sain (A) et d'un échantillon de cellules dérivés du VIH (B) montrent des niveaux de CD80, CD83, CD163 et CD209. L'expérience a été répétée avec deux contrôles supplémentaires et deux échantillons séropositifs supplémentaires avec des résultats similaires. La population cellulaire d'intérêt a été fermée sur la base des paramètres de diffusion vers l'avant et latérale, suivie de la discrimination par doublet. (C) Graphique à barres montrant Les cellules polarisées CD80, CD83, CD163 et CD209 dans les cellules polarisées M1 et M2. Le graphique représente les données moyennes et les écarts types obtenus à partir de trois ensembles de cellules dérivées du VIH (Pts). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Les cellules CD14 de l'homme primaire sont efficacement transfectées avec des miARN. (A) Analyse de cytométrie de flux des monocytes primaires dérivés de contrôles sains, 24 h post-transfection, montrant l'efficacité de transfection de 'gt;90%. (B) L'image confocale représentative prise 24 h après la transfection montre que toutes les cellules du champ expriment le miRNA conjugué à un colorant proche infrarouge (en blanc). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Viabilité des cellules transfectées. Les barres graphiques représentent la viabilité cellulaire moyenne de deuxpatients séropositifs (A) et de deux témoins sains (B) déterminés à l'aide d'un test colorimétrique, après transfection avec miR-146a-5p ou siRNA à EIF4EBP1 (siRNA) et les contrôles appropriés au jour 1 (A) ou le jour 4 (B), tous testés au jour 7. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Régulation efficace des niveaux de protéines sur la transfection de siRNA/miRNA post-isolement des monocytes CD14. Les monocytes de contrôle et dérivés du VIH (1 x 106 cellules) ont été transfectés au jour 1 (A) ou au jour 4 (C) après l'isolement à l'aide de siRNA contre l'ARNm EIF4EBP1. Les panneaux (B) et (D) représentent la quantification de l'expression EIF4EBP1 par rapport à GAPDH et sont exprimés comme le pourcentage de simulacre pour le patient (Pt) ou le contrôle (Ctrl) (A) ou non transfected pour le patient ou le contrôle (B). (E) Graphique à barres représentatif de deux expériences montrant l'expression miR-146a-5p dans des cellules dérivées du VIH transfectées au jour 4 (barres 1-4) ou au jour 1 (barre droite) et récoltées au jour 7. La modification du pli est calculée sur l'échantillon non transfecté (siR et siRNA). siRmD ou miR-145a-5pMD indiquent l'incubation des cellules avec l'ARNc ou le miR-146a-5p sans le réactif de transfection. L'expérience a été répétée 2x avec des cellules dérivées du contrôle et a produit essentiellement les mêmes résultats (données non montrées). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le protocole présenté démontre l'utilisation de cellules primaires de sujets infectés par le VIH comme modèle pour l'étude des monocytes et des macrophages. Les patients atteints de VIHet de coart vivent avec une infection pendant plusieurs années et peuvent également avoir d'autres co-infections liées à un système immunitaire compromis. Pour étudier l'immunomodulation en présence d'une infection chronique par le VIH, des cellules ont été prélevées directement sur des patients. Comme il a été démontré que les miARN jouent un rôle majeur dans le développement et la différenciation des cellules, le protocole met l'accent sur la capacité de manipuler l'expression de l'ARNm dans ces cellules primaires(Figure 2, Figure 3, Figure 4). En utilisant la même procédure, ce protocole fonctionne également très bien pour les siRNAs (Figure 3, Figure 4). En raison de l'activité phagocytique potentielle des macrophages matures, en plus des contrôles siRNA simulés et brouillés, un contrôle est utilisé (indiqué comme siR mou à la figure 3 et à la figure 4), dans lequel le réactif de transfection est omis. Les données confirment que le réactif de transfection est nécessaire pour une livraison appropriée de siRNA/miRNA dans les cellules, car sans le réactif, les cellules n'assument pas spontanément le miRNA ou le siRNA, même lorsqu'elles sont déjà différenciées en macrophages (jour 4 après le placage et la polarisation, Figure 3 et Figure 4).
Tout en utilisant des kits disponibles dans le commerce pour l'isolement et la transfection des cD14 primaires humains- monocytes, il ya des étapes clés optimisées pour rendre la procédure reproductible et réussie. Plus précisément, 1) le nombre de cellules plaquées est essentiel pour leur survie et leur différenciation, et 1 x 106 cellules/35 mm plat s'est avéré pour fonctionner le mieux. 2) Les cellules CD14et nouvellement isolées ne s'attachent pas uniformément au plat de culture si elles sont enseisées en présence de FBS. En conséquence, lors du remplacement du milieu 4 h après la transfection, toutes les cellules non attachées seront enlevées, ce qui rend les conditions de plaque à plaque très variables. 3) Il a été constaté que le remplacement du milieu 4 h après la transfection, réduit la toxicité due à la transfecting réactifs tout en n'affectant pas l'efficacité de la transfection. 4) Les conditions de transfection ont été optimisées pour exiger moins de siRNA ou de miRNA (15 nM) que les concentrations recommandées par le fabricant (25 nM). 5) En raison de la nature fortement adhérente des cellules, l'ajout de tampon de lyse directement à la plaque améliore considérablement la concentration des protéines ou de l'ARN récoltés. Cependant, s'il est nécessaire d'enlever les cellules de la plaque (c.-à-d. pour l'analyse de cytométrie de flux), il est préférable d'utiliser PBS avec EDTA et gratter doucement les cellules. Cette méthode réduit le nombre de cellules recueillies d'environ 20%-30%, il est donc important de planifier des expériences en conséquence pour obtenir des nombres cellulaires suffisants pour une analyse plus approfondie.
Lorsqu'elle est suivie correctement, cette procédure démontre l'obtention d'unepopulation de monocytes cdaurifiques très pure, la transfection de siARN et de petits ARN tels que les miARN, les conditions de culture et la différenciation en macrophages M1 ou M2. Cette méthode peut être appliquée pour étudier des maladies complexes ou des infections autres que le VIH.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs aimeraient remercier le noyau de biorepository clinique/tumoral du VIH d'avoir fourni des échantillons de patients et le noyau de métabolisme d'immunologie cellulaire pour fournir l'analyse de cytométrie de flux. Ce projet a été financé par NIH P20GM121288 et P30GM114732.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
References
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