Karakteriserer individuelle protein aggregater av infrarød Nanospectroscopy og Atomic Force mikroskopi

Summary

Vi beskriver anvendelsen av infrarød nanospectroscopy og høyoppløselig Atomic Force mikroskopi å visualisere prosessen av protein selv-montering i oligomer aggregater og amyloid fibrils, som er nært knyttet til utbruddet og utvikling av et bredt spekter av menneskelige nevrodegenerative lidelser.

Abstract

Fenomenet protein misfolding og aggregering resulterer i dannelsen av svært heterogene protein aggregater, som er forbundet med nevrodegenerative forhold som Alzheimers og Parkinsons sykdommer. Spesielt lav molekylvekt aggregater, amyloid oligomers, har vist å ha generiske cytotoksisk egenskaper og er innblandet som nervegifter i mange former for demens. Vi illustrerer bruken av metoder basert på Atomic Force mikroskopi (AFM) for å ta opp den utfordrende oppgaven med å karakteriserer de morfologiske, strukturelle og kjemiske egenskapene til disse aggregater, som er vanskelig å studere ved hjelp av konvensjonelle strukturelle metoder eller bulk Biofysiske metoder på grunn av deres heterogenitet og forbigående natur. Skanning sonde mikroskopi tilnærminger er nå i stand til å undersøke morfologi av amyloid aggregater med sub-nanometer oppløsning. Vi viser her at infrarød (IR) nanospectroscopy (AFM-IR), som samtidig utnytter den høye oppløsningen av AFM og kjemisk anerkjennelse makt IR spektroskopi, kan gå videre og aktivere karakterisering av de strukturelle egenskapene til individuelle protein aggregater, og dermed gi innsikt i aggregering mekanismer. Siden tilnærmingen som vi beskriver kan brukes også til undersøkelser av interaksjoner av protein forsamlinger med små molekyler og antistoffer, kan det levere grunnleggende informasjon for å utvikle nye terapeutiske forbindelser å diagnostisere eller behandle nevrodegenerative lidelser.

Introduction

Over 40 000 000 mennesker over hele verden er for tiden påvirket av nevrodegenerative lidelser, slik som Alzheimers (AD)¹ og PARKINSONS (PD)² sykdommer. Mer generelt er mer enn 50 patologi forbundet på molekylnivå med protein misfolding og aggregering, en prosess som fører til spredning av uløselig fibrillær protein aggregater, kjent som amyloid innskudd^{3, 4}. den molekylære opprinnelsen til neurodegeneration og dens forbindelser med protein conformational endringer av proteiner som fører til amyloid dannelse, er imidlertid fortsatt uklart, i stor grad på grunn av det høye nivået av heterogenitet, forbigående natur og nanoskala dimensjoner av patologisk aggregater^4,5.

Svært vellykkede undersøkelser av proteinstrukturer i de siste flere ti år har vært basert mye på bruk av bulk metoder, inkludert røntgen crystallography, mikroskopi og kjernefysisk magnetisk resonans spektroskopi^{5, 6} andre priser ^{, 7} andre er ^{, 8} på alle ^{, 9}. innenfor denne klassen av teknikker, infrarød (IR) spektroskopi har dukket opp som en følsom analytisk verktøy for å løse de kjemiske egenskapene til biologiske systemer som proteiner⁸. IR metoder tillate kvantifisering av protein sekundær og kvartær strukturelle endringer i løpet av deres misfolding og aggregering. I tillegg, for å ytterligere dechiffrere på mikroskopisk nivå mekanistisk detaljer involvert i komplekse gratis energi landskap protein under aggregering deres, en stor forhånd har vært utviklingen av kjemiske Kinetics verktøy for å utvide til komplekse selv montering trasé inkludert amyloid fibrils formasjon^{5,6,7,10,11,12}. Men bulk spektroskopiske metoder gir bare gjennomsnittlig informasjon om den heterogene ensemble av arter til stede i løsning eller involvert i bestemte mikroskopiske skritt, og dermed rendering etterforskningen av Biofysiske egenskapene til individuelle aggregerte arter utfordrende på nanoskala nivå^13,14.

Flere mikroskopi teknikker med evne til å operere på skalaer mindre enn den Diffraksjon grensen av lys har dukket opp i de siste ti årene. Denne klassen av metoder inkluderer elektron mikroskopi (EM) og Atomic Force mikroskopi (AFM). Mens skanning elektron mikroskopi (SEM) og overføring elektron mikroskopi (TEM) gir to-dimensjonale (2D) bilder av en prøve, har AFM dukket opp i de siste ti årene som en kraftfull og allsidig teknikk for å studere tredimensjonale (3D) morfologier, som vel som nanomekanikk egenskapene til en prøve med sub-nanometer oppløsning^{13,14,15,16,17,18,19, 20} priser og ^{, 21} priser og ^{, 22} av ^{, 23} andre ^{, 24} priser og ^{, 25} priser og ^{, 26} i ^{, 27}. begrunnelsen bak studere protein aggregering via AFM er at denne tilnærmingen gjør det mulig etterforskning av morfologi av enkelte arter til stede i løsning^{13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37}. Spesielt ved å overvåke prøven som en funksjon av tid, kan AFM etterforskningen av utviklingen av morfologi av artene i prøven, noe som gjør det mulig å følge og visualisere trasé av amyloid formasjon^{23, 25,38,39,40,41,42}. Videre gjør AFM kvantifisering av strukturelle parametre som tverrsnitt høyder og lengder av de enkelte artene som finnes i løsning^{13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44} for alle ^{, 45} for alle ^{, 46} for alle ^{, 47} for alle ^{, 48}. men studiet av en enkelt Biofysiske eiendom, for eksempel morfologi, er ofte ikke tilstrekkelig når man studerer heterogene og komplekse biologiske systemer. AFM, SEM eller TEM Imaging metoder alene ikke lett avsløre kjemiske egenskaper av heterogene arter av amyloid aggregater på nanoskala.

Et stort forskudd for analyse av heterogene biologiske prøver på denne skalaen har blitt gjort nylig med utvikling og anvendelse på feltet protein aggregering av infrarød nanospectroscopy (AFM-IR)^{24,26, 38,42,49,50,51,52}. Denne innovative metoden utnytter kombinasjonen av romlig oppløsning av AFM (~ 1 − 10 NM) med den kjemiske analyse kraft av IR. Den AFM-IR teknikk er basert på måling av photothermal indusert resonans Effektdrevet av en IR laser, og på måling av termisk ekspansjon av prøven under etterforskning av AFM spissen. Prøven kan være opplyst av IR laser direkte fra toppen eller fra bunnen i total intern refleksjon, på samme måte som i konvensjonell infrarød spektroskopi^24,42,52,53 . IR-laseren kan være pulserende med typiske frekvenser i rekkefølgen av hundrevis av kilohertz (1 − 1000 kHz) og innstilt over et bredt Spectral-område, vanligvis mellom 1000 − 3300 cm^-1. Selv om laser kilden dekker et område på ~ 30 μm diameter, den romlige oppløsningen av AFM-IR teknikk bestemmes nominelt av AFM spissen diameter, som oppdager den lokale termiske utvidelsen av systemet. AFM-IR er godt egnet til å studere biologiske prøver fordi IR-signalet er proporsjonal med deres tykkelse opp til 1 − 1.5 μm, og den resulterende IR Spectra er generelt enige med den tilsvarende FTIR overføring Spectra^{13,54 ,55}. Av denne grunn, etablerte metoder for analyse i spektroskopi kan lett anvendes, slik som studiet av kjemiske SKIFT, band form endring og de-convolution av andre derivater analyse⁵². Samlet kombinerer romlig oppløsning av AFM med kjemisk anerkjennelse makt IR spektroskopi, AFM-IR muliggjør samtidig oppkjøp av et bredt spekter av morfologiske, mekaniske og kjemiske egenskaper av en prøve på nanoskala.

Her illustrerer vi en protokoll for karakterisering av prosessen med protein aggregering som utnytter kombinasjonen av in vitro fluorescens analyser, høyoppløselig AFM Imaging og nanoskala AFM-IR. Denne kombinerte tilnærmingen har allerede utmerket seg i å gi detaljerte resultater i å studere de kjemiske og strukturelle egenskapene til individuelle mikro-dråper dannet av protein aggregater, i studiet av væske-flytende protein fase separasjon, og i gransker heterogenitet og Biofysiske egenskaper for individuelle aggregerte arter ved nanoskala^{23,26,38,45,50,53, 56,57}.

Protocol

1. aggregering analyser på fluorescens plate lesere Merk: protokollen beskrevet her er et eksempel på hvordan å studere aggregering av protein eller peptid av kjemiske Kinetics. Spesielt beskriver det en optimalisert protokoll for å studere aggregering av aβ 42 peptid, som er involvert i utbruddet og progresjon av Alzheimers sykdom58,59. En lignende protokoll kan justeres og vedtatt mot studere aggregering av protein eller peptid.</…

Representative Results

En representativ tid løpet av Aβ 42 aggregering, målt ved ThT fluorescens analysen, er vist i figur 1. Aggregering prosessen er vanligvis preget av en sigmoidal kurve, der en lag fase er i utgangspunktet observert, og etterfølges av en bratt vekstfase, før kurven når et platå når en likevekt steady state er nådd6,7 , 58. det er viktig å sikre at en optimalisert aggregering protokollen bruk…

Discussion

Det første kritiske trinnet i denne protokollen er utarbeidelse av monomere proteiner, slik som i tilfelle av Aβ 42 løsning beskrevet i trinn 1,1 og 1,2. Det er viktig å starte aggregering prosessen fra en svært ren, monomere løsning, som tilstedeværelsen av oligomer eller aggregerte arter kan føre til dårlig reproduserbarhet av aggregering Kinetics⁵⁸, og indusere gjenstander i AFM målinger (f. eks, fibrillær arter vil være tydelig på de innledende stadier av aggregering), som kan fø…

Materials

AFM-IR system	Anasys Instruments	nanoIR 2 or 3	Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate	Corning	3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape	Corning	6570
Double Sided Adhesive Discs	AGAR Scientific	AGG3347N
FLUOstar Omega	BMG Labtech	415-101	Platereader
Mica Disc 10mm V1	AGAR Scientific	AGF7013
Park NX10 AFM system	Park Systems	N/A	Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips	Platypus Technologies	AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers	Park Systems	PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL	Eppendorf	30108132
Silicon gold coated cantilevers	Anasys Instruments	PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm	AGAR Scientific	AGF7001