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Biochemistry

Caractérisation des agrégats de protéines individuels par nanospectroscopie infrarouge et microscopie de force atomique

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/60108
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry, University of Cambridge, 2Institute of Biotechnology, Life Sciences Center, Vilnius University, 3Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge

Summary

Nous décrivons l'application de la nanospectroscopie infrarouge et de la microscopie à haute résolution pour visualiser le processus d'auto-assemblage des protéines dans les agrégats oligomériques et les fibrilles amyloïdes, qui est étroitement associée à l'entrée et au développement d'un large éventail de troubles neurodégénératifs humains.

Abstract

Le phénomène de l'épandage et de l'agrégation de protéines induits en protéines entraîne la formation d'agrégats protéiques très hétérogènes, qui sont associés à des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson. En particulier les agrégats de faible poids moléculaire, oligomères amyloïdes, ont été montrés pour posséder des propriétés cytotoxiques génériques et sont impliqués comme neurotoxines dans de nombreuses formes de démence. Nous illustrons l'utilisation de méthodes basées sur la microscopie de la force atomique (AFM) pour répondre à la tâche difficile de caractériser les propriétés morphologiques, structurelles et chimiques de ces agrégats, qui sont difficiles à étudier à l'aide de structures conventionnelles méthodes biophysiques en vrac en raison de leur hétérogénéité et de leur nature transitoire. Les approches de microscopie des sondes de balayage sont maintenant capables d'étudier la morphologie des agrégats amyloïdes avec une résolution sous-nanométrique. Nous montrons ici que la nanospectroscopie infrarouge (IR), qui exploite simultanément la haute résolution de l'AFM et la puissance de reconnaissance chimique de la spectroscopie IR, peut aller plus loin et permettre la caractérisation des propriétés structurelles des individus protéines, et offrent ainsi un aperçu des mécanismes d'agrégation. Puisque l'approche que nous décrivons peut également être appliquée aux investigations des interactions des assemblages de protéine avec de petites molécules et anticorps, elle peut fournir l'information fondamentale pour développer de nouveaux composés thérapeutiques pour diagnostiquer ou traiter neurodegenerative.

Introduction

Plus de 40 millions de personnes dans le monde sont actuellement touchées par des troubles neurodégénératifs, tels que la maladie d'Alzheimer (MA)1 et la maladie de Parkinson (PD)2 maladies. Plus généralement, plus de cinquante pathologies sont associées au niveau moléculaire à la méplication et à l'agrégation des protéines, un processus qui conduit à la prolifération d'agrégats insolubles de protéines fibrillaires, connus sous le nom de dépôts amyloïdes3, 4. Les origines moléculaires de la neurodégénérescence et ses liens avec les changements conformationnels protéiques des protéines conduisant à la formation d'amyloïdes, cependant, restent incertaines, en grande partie en raison du niveau élevé d'hétérogénéité, de nature transitoire et de nanoéchelle dimensions des agrégats pathologiques4,5.

Les études très réussies des structures protéiques au cours des dernières décennies ont été largement basées sur l'utilisation de méthodes en vrac, y compris la cristallographie aux rayons X, la microscopie cryo-électronique et la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire5, 6 Annonces , 7 Annonces , 8 Annonces , 9. Dans cette catégorie de techniques, la spectroscopie infrarouge (IR) est apparue comme un outil d'analyse sensible pour démêler les propriétés chimiques des systèmes biologiques tels que les protéines8. Les méthodes d'IR permettent la quantification des changements structurels secondaires et quaternaires de protéine pendant leur malplier et agrégation. En outre, afin de déchiffrer davantage au niveau microscopique les détails mécanistes impliqués dans les paysages complexes d'énergie libre de protéines au cours de leur agrégation, une avancée majeure a été le développement d'outils de cinétique chimique pour s'étendre à la complexité voies d'auto-assemblage, y compris la formation de fibrilles amyloïdes5,6,7,10,11,12. Cependant, les méthodes spectroscopiques en vrac ne fournissent que des informations moyennes sur l'ensemble hétérogène d'espèces présentes en solution ou impliquées dans des étapes microscopiques spécifiques, rendant ainsi l'étude des propriétés biophysiques des individus espèces agrégées défiant au niveau nanométrique13,14.

Plusieurs techniques de microscopie avec la capacité de fonctionner sur des échelles plus petites que la limite de diffraction de la lumière ont émergé au cours des dernières décennies. Cette classe de méthodes comprend la microscopie électronique (EM) et la microscopie par force atomique (AFM). Alors que la microscopie électronique à balayage (SEM) et la microscopie électronique de transmission (TEM) fournissent des images bidimensionnelles (2D) d'un spécimen, l'AFM est apparue au cours des dernières décennies comme une technique puissante et polyvalente pour étudier les morphologies tridimensionnelles (3D), ainsi que les propriétés nanomécaniques d'un échantillon avec la résolution de sous-nanomètre13,14,15,16,17,18,19, 20 Ans, états-unis , 21 Ans, états-unis , 22 Ans , 23 Ans, états-unis , 24 Ans, états-unis , 25 Annonces , 26 Annonces , 27. La raison d'être de l'étude de l'agrégation des protéines par l'intermédiaire de l'AFM est que cette approche permet d'étudier la morphologie des espèces individuelles présentes dans la solution13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. En particulier, en surveillant l'échantillon en fonction du temps, l'AFM permet d'enquêter sur l'évolution de la morphologie de l'espèce au sein de l'échantillon, ce qui permet de suivre et de visualiser les voies de la formation amyloïde23, 25,38,39,40,41,42. En outre, l'AFM permet de quantifier les paramètres structurels tels que les hauteurs transversales et les longueurs des espèces individuelles présentes dans la solution13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 Ans, en est à qui , 45 Annonces , 46 Annonces , 47 Annonces , 48. Cependant, l'étude d'une seule propriété biophysique, comme la morphologie, n'est souvent pas suffisante pour étudier des systèmes biologiques hétérogènes et complexes. Les méthodes d'imagerie AFM, SEM ou TEM à elles seules ne révèlent pas facilement les propriétés chimiques des espèces hétérogènes d'agrégats amyloïdes à l'échelle nanométrique.

Une avancée majeure pour l'analyse d'échantillons biologiques hétérogènes à cette échelle a été faite récemment avec le développement et l'application dans le domaine de l'agrégation de protéines de la nanospectroscopie infrarouge (AFM-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. Cette méthode innovante exploite la combinaison de la résolution spatiale de l'AFM (1 à 10 nm) avec la puissance d'analyse chimique de l'IR. La technique AFM-IR est basée sur la mesure de l'effet de résonance induit par photothermale entraîné par un laser IR, et sur la mesure de l'expansion thermique de l'échantillon à l'étude par la pointe de l'AFM. L'échantillon peut être éclairé par le laser IR directement à partir du haut ou du bas en toute réflexion interne, de la même manière que dans la spectroscopie infrarouge conventionnelle24,42,52,53 . Le laser IR peut être pulsé avec des fréquences typiques de l'ordre de centaines de kilohertz (1-1000 kHz) et réglé sur une large portée spectrale, généralement entre 1000-3300 cm-1. Bien que la source laser couvre une superficie de 30 m de diamètre, la résolution spatiale de la technique AFM-IR est déterminée nominalement par le diamètre de la pointe AFM, qui détecte l'expansion thermique locale du système. L'AFM-IR est bien adapté pour étudier les échantillons biologiques parce que le signal IR est proportionnel à leur épaisseur jusqu'à 1,5 m, et les spectres IR qui en résultent sont généralement en accord avec les spectres de transmission FTIR correspondants13,54 ,55. Pour cette raison, les méthodes d'analyse établies en spectroscopie peuvent être facilement appliquées, telles que l'étude des changements chimiques, le changement de forme de bande et la déconvolution par deuxième analyse des dérivés52. Dans l'ensemble, en combinant la résolution spatiale de l'AFM avec la puissance de reconnaissance chimique de la spectroscopie IR, l'AFM-IR permet l'acquisition simultanée d'un large éventail de propriétés morphologiques, mécaniques et chimiques d'un échantillon à l'échelle nanométrique.

Ici, nous illustrons un protocole pour la caractérisation du processus d'agrégation de protéines qui exploite la combinaison des essais de fluorescence in vitro, de l'imagerie AFM haute résolution et de l'AFM-IR à l'échelle nanométrique. Cette approche combinée a déjà excellé dans l'étude des résultats détaillés dans l'étude des propriétés chimiques et structurelles des microgouttes individuelles formées par les agrégats protéiques, dans l'étude de la séparation de la phase des protéines liquides-liquides, et dans étudier l'hétérogénéité et les propriétés biophysiques des espèces agrégées individuelles à l'échelle nanométrique23,26,38,45,50,53, 56,57.

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Protocol

1. Tests d'agrégation sur les lecteurs de plaques de fluorescence

REMARQUE : Le protocole décrit ici est un exemple de la façon d'étudier l'agrégation de toute protéine ou peptide par la cinétique chimique. En particulier, il décrit un protocole optimisé pour étudier l'agrégation du peptide A-42, qui est impliqué dans l'début et la progression de la maladie d'Alzheimer58,59. Un protocole similaire peut être ajusté et adopté pour étudier l'agrégation de toute protéine ou peptide.

  1. Obtenir une solution monomeric très pure d'A-42 grâce à des techniques de chromatographie d'échange d'ions et d'exclusion de taille pour distinguer les fractions de protéines contenant a42, et pour isoler la fraction monomérique d'autres formes agrégées d'A-42 obtenues58 , 59.
  2. Diluer le peptide A-42 dans un tampon de phosphate de sodium de 20 mM, 200 m EDTA au pH 8,058 à une concentration finale désirée allant de 1 à 5 M, dans des tubes à faible liaison de 1,5 mL. Les échantillons prélevés pour les mesures de l'AFM ne doivent pas contenir le colorant fluorescent utilisé dans l'analyse de l'agrégation (thioflavine T, ThT), car il pourrait introduire des artefacts lors du dépôt d'échantillons pour l'analyse de l'AFM. Ainsi, préparer des triplicates de deux solutions identiques: i) le premier contenant monomeric A-42 pour suivre le processus d'agrégation par l'AFM; ii) le second contenant le monomeric A-42 avec l'ajout de 20 M ThT comme traceur pour surveiller la cinétique de l'agrégation.
    REMARQUE : Il est important d'effectuer les étapes 1.1 et 1.2 sur la glace. Cette procédure est de s'assurer que la solution monomeric A-42 ne s'agrége pas avant d'être initiée dans le lecteur de plaque. Lors de la manipulation d'échantillons, un tuyauterie soigneux est essentiel pour éviter l'introduction de bulles d'air qui pourraient affecter l'échantillon de protéines.
  3. Pipette 80 l de chaque échantillon dans chaque puits d'une plaque de 96 puits en demi-zone de polystyrène noir avec des surfaces claires et non contraignantes.
  4. Scellez la plaque avec une feuille pour minimiser l'évaporation de l'échantillon au cours de l'agrégation.
  5. Équilibrez la température du lecteur de plaque à 37 oC.
  6. Configurez le protocole d'agrégation pour lire les mesures de fluorescence à intervalles fixes, à une longueur d'onde d'excitation de 440 nm et une longueur d'onde d'émission de 480 nm. L'agrégation doit être initiée dans des conditions calmes.
  7. Insérez la plaque dans le lecteur de plaque.
    REMARQUE : Il est important d'être prudent lors de la manipulation de la plaque, pour s'assurer que l'agrégation n'est pas déclenchée avant de commencer le lecteur de plaque. Utilisez les paramètres d'ajustement de gain pour assurer la lecture optimale de la fluorescence de chaque échantillon.
  8. Démarrez la mesure.
    REMARQUE: L'expérience d'agrégation est terminée lorsque la courbe sigmoïdale de fluorescence ThT atteint un plateau58.

2. Préparation d'échantillons pour les mesures AFM et nano-IR

  1. Collez le disque De microa de qualité la plus élevée sur un disque magnétique en acier inoxydable de haute qualité à l'aide d'onglets adhésifs ou de ruban adhésif recto-verso.
  2. Etch mica en plaçant un morceau de ruban adhésif sur la surface du mica et en en retirant la couche supérieure du mica. Cette procédure produira une surface propre et atomiquement plate, adaptée aux dépôts d'échantillons.
    REMARQUE : La surface gravée doit être uniforme et lisse.
    CAUTION: Ne pas toucher ou respirer directement au-dessus de mica fraîchement gravé, car cela va introduire des artefacts.
  3. Pause / arrêt de la mesure du lecteur de plaque pour recueillir le point de temps d'intérêt pendant le processus d'agrégation de la protéine.
  4. Retirer le papier d'étanchéité et recueillir 10 aliquot ll des échantillons sans ThT du puits dans un tube de 1,5 ml à faible liaison.
  5. Déposer les 10 ll de l'échantillon sur le mica fraîchement gravé. Pour les mesures AFM-IR, les échantillons doivent être déposés sur un substrat d'or fraîchement rayé.
  6. Incuber la solution sur le mica pendant 1 min pour permettre la physisorbtion.
    REMARQUE : Un temps d'incubation plus long permettrait une meilleure absorption à la surface, mais pourrait induire l'auto-organisation artificielle et l'auto-assemblage25. Pour éviter ces effets, le dépôt de pulvérisation peut être exploité25.
  7. Rincer trois fois avec 1 ml d'eau ultrapure.
  8. Sécher sous un flux doux d'azote pour mesurer l'échantillon dans l'environnement de l'air.

3. Imagerie AFM de la morphologie des agrégats protéiques

REMARQUE : Les mesures de morphologie peuvent être effectuées en mode de contact et dynamique, dans les étapes suivantes, cette dernière est décrite car elle réduit les forces latérales pour mesurer la morphologie 3D de l'échantillon avec une haute résolution. Les mesures AFM-IR seront effectuées en mode contact afin d'améliorer le rapport signal-bruit AFM-IR.

  1. Allumez le système AFM au moins 30 minutes avant les mesures afin de permettre au système d'atteindre la stabilité thermique. Cliquez sur Setup, puis sur Probe. Dans la fenêtre de changement de sonde cliquez sur Suivant pour préparer Z, Focus Stage.
  2. Éteignez l'interrupteur de faisceau AFM (s'il est allumé). Déverrouillez les serrures de queue d'aronde, déconnectez la tête du système et dans la fenêtre de changement de sonde cliquez sur Suivant.
  3. Montez le porte-à-faux AFM sur le porte-sonde. Connectez la tête au système et verrouillez les serrures en queue d'aronde.
    REMARQUE : Les cantilevers optimaux pour étudier les échantillons biologiques en mode dynamique AFM ont constante de ressort s'étendant entre 2-40 N m-1 et un radii d'apex s'étendant entre 2-8 nm14.
  4. Allumez l'interrupteur de faisceau laser AFM et dans la fenêtre de changement de sonde cliquez sur Suivant.
  5. Dans la fenêtre pop-up cliquez sur Non si le type de porte-à-faux n'a pas changé. Ajuster les boutons d'alignement optique pour trouver le porte-à-faux. Ajustez-vous sur le porte-à-faux et cliquez sur Suivant.
  6. Dans la fenêtre pop-up cliquez sur Oui si l'accent est mis sur le porte-à-faux.
  7. Placez le faisceau laser à l'extrémité du porte-à-faux à l'aide des boutons contrôlant la position du laser de détection. Maximisez le signal total mesuré par le photodiode à quatre quadrants à au moins 1 V à l'aide des boutons contrôlant la position du faisceau laser dévié sur la photodiode sensible à la position (PSPD). Dans la fenêtre Dechange Deson cliquez sur Suivant, puis sur Fermer.
  8. Attendez 15 min pour que le porte-à-faux atteigne la stabilité thermique. Réajuster la position du faisceau laser dévié sur le PSPD si nécessaire.
  9. Cliquez sur NCM SWEEP, choisissez l'amplitude désirée de l'oscillation, cliquez sur La phased'utilisation, cliquez sur l'auto et accordez le porte-à-faux près du maximum de sa première résonance libre d'oscillation, qui est d'environ 300 kHz pour un en porte-à-faux avec une constante printanière de 40 Nm -1.
    REMARQUE: Tuning le porte-à-faux hors du maximum de sa résonance libre assure une plus grande stabilité des mesures14.
  10. Placez l'échantillon sur le porte-échantillon. Choisissez des paramètres d'imagerie appropriés. Le taux de numérisation typique est de 0,3 à 1,0 Hz pour une zone d'analyse de 1 x 1 m2 à 5 x 5 m2. La résolution typique nécessaire se situe entre 256 x 256 et 1024 x 1024 pixels. Cliquez sur Scan Area pour choisir la taille de l'analyse et le nombre de pixels.
  11. Concentrez la vue optique sur l'échantillon. Cliquez sur Approche pour approcher la surface de l'échantillon. Une fois l'approche terminée, cliquez sur Lesque10 pour lever la pointe de l'AFM à 100 m au-dessus de la surface de l'échantillon. Cliquez Sur Développer l'image optique de l'échantillon. Cliquez sur la barre Focus Stage pour concentrer la vue sur la surface de l'échantillon.
  12. Utilisez les flèches pour vous déplacer dans la région de l'échantillon d'intérêt. Engagez la surface en appuyant sur le bouton Approche. Cliquez sur le bouton Scan line et vérifiez si la pointe suit bien la surface, si nécessaire, ajustez le point d'ensemble .
  13. Commencez à imageriede la surface de l'échantillon en appuyant sur le bouton Scan. Pendant l'imagerie, afin d'éviter une grande force d'imagerie et de conserver la cohérence dans les échantillons indépendants, maintenir un régime constant de changement de phase ne dépassant pas 20'42.
  14. Entrez le nom du fichier et choisissez l'annuaire de base où l'image acquise sera enregistrée.

4. Mesures de nanospectroscopie infrarouge des agrégats protéiques

  1. Allumez le système AFM-IR et le laser infrarouge (IR)60 30 à 60 min avant les mesures de stabilisation thermique. Les lasers typiques pour les instruments AFM-IR sont les oscillateurs de paramètres optiques (OPO) et les lasers en cascade quantique (QCL).
  2. Ouvrez le logiciel intégré pour contrôler l'instrument. Cliquez sur le fichier, puis sur le nouveau pour ouvrir un nouveau fichier nanoIR. Appuyez sur le bouton initialise pour démarrer le système AFM-IR.
  3. Ouvrez le couvercle de l'instrument et montez sur le système AFM-IR une sonde enduite d'or de silicium avec un rayon nominal de 30 nm et une constante printanière de 0,2 N/m pour mesurer l'échantillon en mode contact.
  4. Cliquez sur Charge dans la section AFM sonde, puis la prochaine. En se concentrant sur la section de sonde cliquez sur les flèches pour concentrer la caméra sur le porte-à-faux. Dans l'échantillon de section XY mouvement, utiliser les flèches pour placer l'air transversal à l'extrémité du porte-à-faux.
  5. Faites pivoter les boutons contrôlant la position du laser de détection pour positionner le laser à l'extrémité du porte-à-faux. Faites pivoter les boutons laser pour détecter et maximiser la somme mesurée par le photodiode à quatre quadrants à une valeur de 3 V. Faites pivoter le bouton de déviation pour ajuster la déviation en porte-à-faux à -1 V, puis cliquez ensuite. Fermez la couverture de l'instrument.
  6. Dans la section, concentrez-vous sur l'utilisation de l'échantillon pour concentrer la caméra sur l'échantillon. Ensuite, dans la section l'échantillon XY mouvement utiliser les flèches pour se déplacer dans la région d'intérêt de l'échantillon et cliquez sur l'approche et de s'engager.
  7. Dans la fenêtre du microscope sélectionnez comme entrées les canaux d'intérêt pour cartographier les propriétés biophysiques de l'échantillon. En particulier, choisissez la hauteur pour la morphologie, l'amplitude 2 pour l'absorption de l'IR et la fréquence PLL pour cartographier la résonance de contact tip-sample.
  8. Dans la section d'analyse AFM de la fenêtre de contrôle, utilisez des paramètres similaires à ceux de la section 3 (c.-à-d. le taux d'analyse 0,1 à 1,0 Hz, entre 256 x 256 et 1024 x 1024 pixels). Choisissez comme valeur des gains en fonction de la rugosité de l'échantillon : intégrale I 1 à 10 et P proportionnel à 10-30. Ensuite, cliquez sur l'analyse pour acquérir une carte de morphologie.
    REMARQUE : La morphologie peut être mesurée de la même façon en mode d'adtension dynamique, mais les mesures AFM-IR sont effectuées ici en mode contact pour avoir des rapports signal/bruit plus élevés.
  9. Une fois la cartographie de la morphologie terminée, dans la fenêtre du microscope, cliquez sur la carte de hauteur pour positionner la sonde sur le dessus d'un agrégat. Ensuite, dans la section nanoIR de la fenêtre de contrôle, cliquez sur démarrer IR pour éclairer l'échantillon avec le laser IR.
  10. Pour concentrer le laser infrarouge sur le porte-à-faux, cliquez sur l'optimisation. Dans cette fenêtre, écrivez un numéro d'onde où l'échantillon va avoir une absorption élevée et cliquez sur ajouter. Pour les protéines, une valeur typique est de 1655 cm-1. Cliquez sur l'analyse pour trouver la position laser IR et cliquez sur mise à jour pour aligner sa position avec le porte-à-faux. Fermez la fenêtre.
  11. Dans la section générale du réglage nanoIR, écrivez un nombre d'ondes où l'absorption élevée dans le champ relatif est prévue. Ensuite, désactivez l'option Filtre De Band Pass et regardez la lecture du compteur et la transformation rapide de Fourier (FFT) de la réponse en porte-à-faux. Dans la fenêtre FFT déplacer le curseur vert pour lire la fréquence de résonance du porte-à-faux. Une valeur typique de la FFT de la résonance des cantilevers est d'environ 300 kHz. Écrivez cette valeur de fréquence de résonance dans la section générale dans le champ central de freq. et utilisez une fenêtre freq. de 50 kHz.
    REMARQUE : Sélectionnez une puissance laser suffisamment basse pour ne pas saturer la lecture du compteur et distoper la réponse en porte-à-faux et ne pas surchauffer l'échantillon.
  12. Cliquez sur la fenêtre de l'impulsion laser pour utiliser le mode de résonance améliorée. Choisissez un centre de fréquence de 300 kHz, une plage de tune de 50 kHz et un cycle de service du laser de 5%. Cliquez sur acquérir pour balayer le pouls du laser. En utilisant le curseur dans le graphique, accordez l'impulsion laser à la fréquence de la réponse mécanique de l'expansion thermique de l'échantillon absorbant la lumière infrarouge. Ensuite, sélectionnez l'option PLL pour surveiller la résonance de contact entre l'échantillon et la pointe. Appuyez sur le bouton zéro dans la fenêtre Et la tique PLL permettent de suivre la résonance de contact de l'échantillon-pointe. Choisissez un gain intégral I 0,5 et un gain proportionnel P 10. Fermez la fenêtre.
  13. Ouvrez à nouveau la fenêtre d'optimisation et trouvez la position du laser IR pour au moins 3 nombres d'ondes correspondant aux bandes d'absorption majeures de l'échantillon (bande d'amide I-II-III) et pour au moins un numéro d'onde pour chaque puce du laser.
  14. Cliquez sur Outils (fr) Calibration de fond de l'IR (fr) Nouveau. Dans la fenêtre, sélectionnez la région spectroscopique d'intérêt (1800 à 1200 cm-1 pour étudier des échantillons de protéines); choisir le même pouls que celui déterminé à l'étape 4,12 et un cycle de service de 5 %; cliquez sur l'acquisition rapide et sélectionnez la vitesse laser, gamme typique pour un laser cascade quantique est entre 20-500 cm-1. Cliquez sur acquérir pour mesurer le fond laser IR. Ce spectre de fond sera utilisé pour la normalisation des spectres localisés à l'échelle nanométrique mesurée. Fermez la fenêtre.
    REMARQUE : Si un laser rapide et un mode de résonance amélioré ne sont pas disponibles, sautez l'étape 4.12 et sélectionnez les spectres à pas au lieu de jeûner à la fois dans les fenêtres d'acquisition de spectres d'arrière-plan et d'IR. Toutefois, la sensibilité agrégée unique ne sera pas atteinte.
  15. Dans les paramètres des spectres INFRAROUGEs, choisissez une résolution du spectre INFRAROUGE entre 1/4 cm-1 et un nombre de co-moyennes d'au moins 64x. Cliquez sur l'acquisition pour mesurer un spectre D'IR localisé à l'échelle nanométrique dans la gamme de protéines (1800-1200 cm-1).
  16. Pour acquérir une carte chimique résolue à l'échelle nanométrique, sélectionnez l'option d'imagerie INFRAROUGE, choisissez un nombre d'ondes d'intérêt (p. ex., 1655 cm-1 pour la bande amide I) et cliquez sur le balayage dans la fenêtre d'analyse de l'AFM.
  17. Une fois la cartographie terminée, allez déposer et enregistrer les mesures. Pour analyser les cartes acquises de la morphologie, de la résonance de contact et de la chimie, ainsi que les spectres localisés à l'échelle nanométrique, utilisez le logiciel intégré de traitement d'images AFM. Spectra et Images peuvent être enregistrés sous forme de fichiers .csv ou .axz pour une analyse plus détaillée avec un logiciel commercial.

5. Traitement et analyse d'images de dimensions transversales

  1. Aplatir les images brutes14,17,19,41,42,59 à l'aide de logiciels intégrés de traitementd'images AFM ou de logiciels commerciaux.
    REMARQUE : Les agrégats doivent être masqués à partir du calcul afin d'éviter les artefacts d'analyse et la sous-estimation de leur hauteur mesurée.
  2. Aplatir l'image par 0 plan d'ordre ajustement soustraction.
  3. Aplatir l'image par plan, puis ligne par ligne à un ordre de régression 1st, la deuxième étape est répétée jusqu'à ce que la ligne de base plat dans le profil de ligne de l'image est atteint.
  4. Si l'échantillon est très encombré, contient des agrégats exceptionnellement élevés ou l'artefact d'arc de scanner est présent, aplatir l'image en utilisant 2nd régression ordre ajustement.
  5. Mesurer la hauteur et la largeur globales à partir d'un profil de ligne pris perpendiculairement à l'axe fibril14,17,19,41,42,59.
  6. Mesure longueur fibrile parallèle à l'axe fibril14,17,19,41,42,59.

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Representative Results

Un cours de temps représentatif de l'agrégation de l'A-42, tel que mesuré par l'assiduescence de ThT, est indiqué à la figure 1. Le processus d'agrégation est généralement caractérisé par une courbe sigmoïdale, où une phase de décalage est initialement observée, et est suivie d'une phase de croissance abrupte, avant que la courbe n'atteigne un plateau lorsqu'un état d'équilibre stable est atteint6,7 , 58. Il est essentiel de s'assurer qu'un protocole d'agrégation optimisé est utilisé pour générer des données de haute qualité afin d'étudier les détails moléculaires relatifs aux processus d'agrégation58.

La haute résolution de l'AFM permet d'étudier la morphologie et l'hétérogénéité des espèces agrégées à différents moments du processus. Pendant l'agrégation, surveillée par l'étude ThT, les aliquots de l'échantillon dans les plaques sont préparés pour une seule étude agrégée par l'AFM et le nano-IR (figure 1). Le flux de processus typique de la préparation manuelle de l'échantillon est indiqué à la figure 2. À l'achèvement de la mesure de la morphologie 3D de l'échantillon par aFM à haute résolution et contrôlée par phase, les cartes sont aplaties afin d'éliminer la non-linéarité du scanner piézoélectrique et de réduire les sources d'erreur dans l'analyse post-traitement de l'échantillon morphologie (Figure 3). Par la suite, une analyse statistique précise et sensible d'une seule molécule peut être effectuée, comme le montre la figure 4. À partir d'une carte de morphologie 3D, il est possible d'extraire la hauteur, la largeur et la longueur transversales agrégées (ou diamètre en cas de particules sphéroïdales), ce qui permet de distinguer et de caractériser des espèces distinctes d'agrégats présents pendant le temps d'agrégation. cours23,38. Les points de temps typiques d'intérêt pour étudier le processus d'agrégation sont la phase de décalage, la phase de croissance et la phase de plateau (figure 1). Pendant la phase de décalage, les espèces monomériques et oligomériques d'A-42 sont principalement présentes. Lorsqu'elles sont visualisées par l'AFM, les espèces monomériques et oligomériques d'A-42 apparaissent généralement sous forme de particules sphéroïdales de 1 à 15 nm de diamètre et de 0,3 à 2 nm de hauteur (Figure 1, en basà gauche)38,39. La formation de protofilaments allongés, de protofibrilles et de fibrilles est visible pendant la phase de croissance du cours du temps d'agrégation de l'A-42 (figure 1,milieu inférieur)38,39. Typiquement, les protofilaments apparaissent comme des caractéristiques allongées des centaines de nanomètres de longueur et de 0,5 à 2 nm de hauteur, tandis que les protofibrilles apparaissent comme des agrégats linéaires ou curvilignes allongés de 1 à 5 nm de hauteur et des centaines de nanomètres de longueur38, 39. Pendant la phase du plateau, les fibrilles sont l'espèce dominante des agrégats de l'A-42. Les fibrilles a42 apparaissent généralement comme des structures non ramifiées, en forme de fil, avec un diamètre transversal de 6 à 10 nm et une longueur dans l'ordre si les micromètres (Figure 3, en bas à droite)38,39. Remarquablement, cette représentation schématique des propriétés morphologiques des agrégats est une caractéristique générale de la plupart des protéines et des peptides agrégateurs13,14.

Après l'étude de la morphologie de l'échantillon, nano-IR peut être utilisé pour étudier les propriétés chimiques des différentes espèces d'agrégats protéiques présentes au cours du processus d'agrégation, en acquérant des cartes INFRAROUGEs et des spectres résolus à l'échelle nanométrique dans l'air et environnement liquide indigène24,26,38,4249,50,51,52,. La figure 5 montre une illustration schématique de la configuration AFM-IR. Une source IR est utilisée pour éclairer l'échantillon à partir du bas en reflet interne total ou directement à partir du haut comme dans la figure 5a. Si la lumière infrarouge est absorbée par l'échantillon, elle excitera les niveaux moléculaires correspondants de transition énergétique vibratoire des espèces présentes. L'énergie vibratoire est dissipée à l'intérieur de l'échantillon sous forme de chauffage thermique, ce qui provoque l'expansion thermique de l'échantillon. Cette expansion est mesurée à l'échelle nanométrique par la pointe AFM en contact avec l'échantillon avec une résolution de l'ordre de 10 nm. À chaque impulsion, le porte-à-faux détecte l'expansion thermique. En particulier, l'expansion rapide de l'échantillon expulse le porte-à-faux du contact avec l'échantillon, et après le coup de pied le porte-à-faux sonne vers le bas à ses fréquences naturelles. Afin d'améliorer la sensibilité de l'AFM-IR, il est possible de régler la fréquence d'impulsion laser à la même fréquence de l'oscillation du porte-à-faux54. Afin de travailler dans ce mode de résonance améliorée, il est nécessaire d'avoir des sources IR qui peuvent être pulsées dans un large éventail de fréquences, telles que les lasers en cascade quantique qui fonctionnent généralement dans une gamme comprise entre 1-1000 kHz. L'amplitude de pointe à pic et la transformation rapide de Fourier du signal d'anneau, appelé amplitude IR, de la déviation brute de porte-à-faux sont proportionnelles à la lumière IR absorbée. Ces signaux sont détectés en temps réel en mesurant la déviation d'un laser rouge centré sur le dessus du porte-à-faux. Afin d'acquérir des cartes chimiques, le nombre d'ondes laser est fixé à un certain nombre d'ondes et le signal d'amplitude IR est recueilli à chaque point de la carte, tandis que, pour acquérir des spectres INFRAROUGEs, la position du porte-à-faux est fixée en position d'intérêt et le laser longueur d'onde est balayée le long de la gamme spectroscopique d'intérêt. La résolution finale de l'AFM-IR permet de mesurer les propriétés chimiques des agrégats protéiques d'une hauteur transversale d'environ 5 nm, tel que représenté à la figure 6.

Figure 1
Figure 1 : Surveillance du cours de temps d'agrégation in vitro via la fluorescence ThT et l'AFM.
Les échantillons prélevés pendant la phase de décalage, la phase de croissance et la phase de plateau du processus d'agrégation détectées par la fluorescence ThT ont été photographiés par l'aFM à haute résolution. Ce chiffre a été adapté de Ruggeri et coll.38. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Représentation schématique de la préparation du substrat et des dépôts d'échantillons pour les mesures de l'AFM.
(A, B) Gravure de Mica à l'aide de ruban adhésif. (C) Dépôt d'échantillons. (D) Incubation d'échantillons. (E) Échantillon de rinçant à l'eau ultrapure. (F) Échantillon de séchage sous un flux doux d'azote. (G) Imagerie d'échantillon utilisant le porte-à-faux microfabriqué d'AFM avec la pointe pointue sur son extrémité. (H) Image traitée de fibrilles amyloïdes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Procédure de traitement d'imageaFM 42.
Le haut de chaque panneau montre une ligne de profil de la surface de l'échantillon (ligne rouge) illustrée par l'image AFM correspondante, tandis que la partie inférieure montre un histogramme de la hauteur de tous les pixels de l'image. (a) Image AFM brute avant procédure d'aplatissement de l'image. (b) Image AFM après la procédure de traitement en utilisant l'aplatissement de l'avion entier. Les structures de fibrillaire (couleur rose) ont été masquées de la procédure d'aplatissement. (c) Image traitée à l'aide d'une procédure d'aplatissement ligne par ligne. d) Image finale après la procédure de traitement d'image. Ce chiffre a été adapté de Ruggeri et coll.42.

Figure 4
Figure 4 : Analyse statistique globale unique des images aFM.
(a) Exemple de traçage des hauteurs et des longueurs des structures fibrillaires, indiqué avec 1 et 2. ( b) Graphique avec des sections des fibrilles tracées et leur hauteur moyenne. (c) Exemple d'histogramme montrant la hauteur moyenne des structures fibrillaires. d) Graphique avec profil normalisé des fibrilles tracées 1 et 2. (e) Distribution histogramme des points de hauteur de profil normalisés. Ce chiffre a été adapté de Ruggeri et coll.42. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Principe de fonction de la méthode AFM-IR.
(a) La lumière IR absorbée provoque l'expansion thermique de l'échantillon, excitant les résonances mécaniques du porte-à-faux AFM en contact avec l'échantillon. L'amplitude des oscillations en porte-à-faux est proportionnelle à l'absorption de l'IR. ( b) Des cartes d'absorption ir sont obtenues en scannant le porte-à-faux sur l'échantillon tout en fixant la longueur d'onde laser. (c) Astuce et échantillon en contact se comportent comme un système de ressorts couplés dont la fréquence de résonance augmente monotonalement avec la rigidité intrinsèque de l'échantillon50. d) Les spectres localisés sont obtenus en balayant la longueur d'onde laser tout en fixant la position du porte-à-faux AFM. (e) spectre IR de protéines. f) En résumé, l'AFM-IR permet l'étude simultanée des propriétés morphologiques, mécaniques et chimiques à l'échelle nanométrique26. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Nanospectroscopie infrarouge (nano-IR) d'un agrégat amyloïde unique.
(a) carte de morphologie de l'AFM. (b) Carte d'absorption de l'IR au pic de résonance laser à 1658 cm-1. (c) Dimensions transversales transversales de la hauteur fibrile. d) spectres INFRAROUGEs sur différentes positions de la structure du fibrillaire (marqué dans le panneau b avec des cercles bleus) et du substrat (marqué dans le panneau b avec des cercles verts). Le signal net moyen provenant de la structure agrégée (ligne noire solide) a été obtenu en soustrayant le signal de fond moyen (ligne verte solide) du signal fibril moyen (ligne bleue solide). Ce chiffre a été adapté de Ruggeri et coll.42.

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Discussion

La première étape critique de ce protocole est la préparation de protéines monomériques, comme dans le cas de la solution A-42 décrite dans les étapes 1.1 et 1.2. Il est essentiel d'initier le processus d'agrégation à partir d'une solution monomeric très pure, car la présence d'espèces oligomériques ou agrégées peut entraîner une mauvaise reproductibilité de la cinétique d'agrégation58, et induire des artefacts dans l'AFM (p. ex., les espèces fibrillaires seront évidentes aux premiers stades de l'agrégation), ce qui peut mener à une mauvaise interprétation des données. Les données cinétiques hautement reproductibles de la formation amyloïde basées sur l'analyse de fluorescence de ThT, en association avec le formalisme d'équation principale de la cinétique chimique5,6,7, ont permis de définir l'agrégation d'A-42 mécanisme en termes de ses événements moléculaires sous-jacents. La cinétique chimique relie les étapes microscopiques sous-jacentes à la formation amyloïde avec leurs manifestations macroscopiques en considérant les différentes façons dont de nouveaux agrégats peuvent se former et se développer, qui sont par exemple l'allongement aux extrémités agrégées ou secondaires nucléation sur la surface agrégée. Cependant, la cinétique chimique en elle-même ne permet pas directement la visualisation des phénomènes de nucléation possibles à l'échelle nanométrique nécessitant leur combinaison avec des méthodes à molécule unique.

La deuxième étape critique de ce protocole est la préparation du substrat et les procédures de dépôt de l'échantillon décrites aux étapes 2.2 et 2.6-2.8. Pour éviter les artefacts, l'échantillon doit être déposé sur une surface propre et atomiquement plane. Une gravure adéquate du mica est essentielle pour obtenir une haute résolution sans artefact dans les mesures AFM. Le temps de dépôt de l'échantillon est également extrêmement important, car un temps d'incubation plus long permet une meilleure absorption sur la surface du substrat. Cependant, il pourrait également induire l'auto-organisation artificielle et l'auto-assemblage25, ce qui peut induire des artefacts (p. ex., des espèces agrégées induites par la surface) qui peuvent conduire à une mauvaise interprétation des données. En outre, la surface du mica est chargée négativement, ce qui signifie que seules les molécules chargées positivement absorbent facilement sur elle. Si la charge nette de l'échantillon est négative, la surface du mica peut être fonctionnelle positivement à l'aide d'APTES pour une meilleure phisisorption23. Le dépôt de pulvérisation microfluidique25 peut être exploité pour éviter ces effets et artefacts et déposer l'échantillon en une seule étape et sans artefact.

La troisième étape critique est la configuration appropriée et le choix des paramètres d'imagerie pour l'imagerie par l'aFM et l'IR décrits à la section 3. Les conseils AFM utilisés pour l'imagerie de l'échantillon doivent être suffisamment tranchants (apex radii de 2 à 8 nm) pour atteindre une haute résolution et minimiser les effets de convolution (élargissement des caractéristiques de l'échantillon par la pointe)14, ce qui peut induire des incertitudes dans l'image de l'échantillon. Le choix du mode d'imagerie, contact ou dynamique, est également important. Pour l'imagerie par l'échantillon par l'intermédiaire de l'AFM conventionnel, le mode dynamique est préféré au mode de contact, car ce dernier mode induit de grandes forces latérales de frottement de l'échantillon de pointe qui peuvent causer des dommages à l'échantillon et introduire des artefacts dans les mesures (p. ex., réduction de la hauteur de l'échantillon due à la nanoindentation)14,61,62. Inversement, le mode de contact est préféré pour les mesures via nano-IR pour améliorer le signal AFM-IR. Pour les mesures en mode dynamique, le porte-à-faux doit être accordé juste légèrement en dessous (mode de mise à l'écart) ou au-dessus (mode sans contact) le maximum de sa première résonance libre d'oscillation pour assurer une plus grande stabilité des mesures14. La résolution d'imagerie, qui dépend du nombre de pixels et de la zone d'analyse, doit être suffisamment élevée pour capturer le plus petit degré de détail présent dans un spécimen (p. ex., 1024 x 1024 pixels pour une zone de 4 x 4 m2) 14,63. Une faible résolution d'imagerie peut induire des distorsions et des incertitudes dans l'image de l'échantillon en raison de la perte de l'information verticale et latérale lors de la numérisation du signal14. Le taux d'analyse, utilisé pour l'imagerie, devrait être suffisamment bas pour que la pointe puisse suivre correctement les caractéristiques de la surface et avoir suffisamment de temps pour obtenir des informations chimiques14. L'un des paramètres d'imagerie les plus importants est la force d'imagerie. En mode contact, il est fondamental d'utiliser une faible force d'interaction pour préserver la structure de l'échantillon. En mode dynamique, la dissipation de l'énergie sur les échantillons doit être maintenue constante afin de comparer uniformément la morphologie d'échantillons distincts; l'imagerie cohérente des échantillons indépendants peut être obtenue en maintenant un régime constant d'un changement de phase ne dépassant pas 20'14,42. Les grandes forces d'imagerie doivent être évitées car elles peuvent induire des distorsions et des incertitudes dans les images de l'échantillon.

La dérive thermique causée par l'expansion et la contraction des pièces AFM dues aux fluctuations thermiques peut provoquer des distorsions et des artefacts à l'image de l'échantillon64,65. Les dérives dans la direction verticale peuvent faire perdre la trace de la surface et s'écraser sur la surface, tandis que les dérives dans la direction latérale entraînent généralement une allongement des caractéristiques de la surface et une distorsion de l'image, ce qui rend difficile l'élongation des caractéristiques de la surface et la distorsion de l'image, ce qui rend difficile mesurer avec précision les caractéristiques de l'échantillon. L'effet de ces dérives thermiques peut être minimisé par un contrôle précis de la température du laboratoire ainsi que de donner suffisamment de temps (environ 30 min) pour que le système devienne stable ou en effectuant des scans rapides66,67,68 , 69 Annonces , 70.

La qualité de l'imagerie nano-IR et de la collecte de spectres par L'AFM-IR peut être affectée par plusieurs facteurs, dont les plus importants sont : (i) une mauvaise division du signal IR sur l'échantillon par le fond infrarouge, (ii) une grande variation du contact nanomécanique entre la pointe et l'échantillon, et (iii) un chauffage excessif de l'échantillon provoquant son ramollissement. Pour diviser correctement le spectre IR de l'échantillon par l'arrière-plan recueilli, il est crucial qu'ils soient recueillis à la même puissance laser. En effet, la forme spectrale de la ligne de fond laser IR dépend de la puissance du laser. Ensuite, afin d'éviter l'influence des propriétés mécaniques de l'échantillon dans l'information chimique mesurée, il est crucial de surveiller et de suivre la résonance de contact entre l'échantillon et la pointe lors de l'acquisition de spectres et d'images. Pour l'acquisition de spectres, idéalement, il suffit de faire vibrer le laser à une résonance de contact fixe. Toutefois, si le spectre est acquis sur une grande plage spectroscopique, les pics de haute intensité pourraient provoquer un fort réchauffement de l'échantillon et son ramollissement, modifiant ainsi la résonance de contact de l'échantillon de pointe et réduisant artificiellement l'amplitude de pointe de l'IR. Pour cette raison, il est important de suivre la résonance de contact lors de l'acquisition de spectreafin de vérifier que le spectre n'est pas affecté par un chauffage excessif de l'échantillon.

En conclusion, l'AFM et le nano-IR conventionnels sont capables d'étudier à haute résolution les propriétés morphologiques, structurelles et chimiques des espèces individuelles formant lors de l'agrégation des protéines24,38. Cependant, ils n'ont pas la capacité de la cinétique chimique de suivre leur cinétique rapide de formation dans des conditions indigènes en vrac. Afin de démêler les changements conformationnels que subissent les protéines lors de leur agrégation et de leur mauvaise repli, il est nécessaire de développer et d'appliquer de nouvelles méthodes biophysiques capables de réunir les capacités des méthodes biophysiques en vrac avec le l'étude de l'hétérogénéité et des propriétés ultrastructurales de l'agrégation des protéines à l'échelle nanométrique. Cette approche représente une voie fructueuse pour relever le défi de comprendre le problème de l'auto-assemblage des protéines et son rôle dans la santé et la maladie. En effet, les approches agrégées uniques sont capables de démêler et d'élucider les mécanismes moléculaires du polymorphisme et de la formation de l'agrégation des protéines. Cette information est essentielle pour relever le défi de comprendre l'agrégation des protéines et son rôle dans l'début et la progression des maladies humaines, ainsi que de comprendre leurs propriétés biophysiques pour les applications biotechnologiques.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Les auteurs remercient la Fondation nationale suisse pour la science (SNF) pour le soutien financier (numéro de subvention P2ELP2-162116 et P300P2-171219), le Darwin College, le programme ErasmusMD pour le soutien financier (numéro de subvention 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) et le recherche menant à ces résultats a reçu un financement du Conseil européen de la recherche dans le cadre du septième programme-cadre de l'Union européenne (7e FP/2007-2013) par l'intermédiaire de la subvention PhysProt (accord numéro 337969), de la Fondation Newman (T.P.J.K.) et de Cambridge Centre for Misfolding Diseases (C.G., M.V., et T.P.J.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM-IR system Anasys Instruments nanoIR 2 or 3 Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape Corning 6570
Double Sided Adhesive Discs AGAR Scientific AGG3347N
FLUOstar Omega BMG Labtech 415-101 Platereader
Mica Disc 10mm V1 AGAR Scientific AGF7013
Park NX10 AFM system Park Systems N/A Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips Platypus Technologies AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers Park Systems PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL Eppendorf 30108132
Silicon gold coated cantilevers Anasys Instruments PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm AGAR Scientific AGF7001

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Biochimie Numéro 151 amyloïde neurodégénérescence agrégation de protéines microscopie de force atomique nanospectroscopie infrarouge analyse d'une seule molécule spectroscopie
Caractérisation des agrégats de protéines individuels par nanospectroscopie infrarouge et microscopie de force atomique
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Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Chia, S., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60108, doi:10.3791/60108 (2019).

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