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Biochemistry

Caracterización de agregados de proteínas individuales por nanoespectroscopia infrarroja y microscopía de fuerza atómica

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/60108
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry, University of Cambridge, 2Institute of Biotechnology, Life Sciences Center, Vilnius University, 3Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge

Summary

Describimos la aplicación de nanoespectroscopia infrarroja y microscopía de fuerza atómica de alta resolución para visualizar el proceso de autoensamblaje de proteínas en agregados oligoméricos y fibrillas amiloideas, que está estrechamente asociada con el inicio y desarrollo de una amplia gama de trastornos neurodegenerativos humanos.

Abstract

El fenómeno del desdoblamiento de proteínas y la agregación da como resultado la formación de agregados proteicos altamente heterogéneos, que se asocian con condiciones neurodegenerativas como el Alzheimer y las enfermedades de Parkinson. En particular, los agregados de bajo peso molecular, oligómeros amiloide, han demostrado poseer propiedades citotóxicas genéricas y están implicados como neurotoxinas en muchas formas de demencia. Ilustramos el uso de métodos basados en la microscopía de fuerza atómica (AFM) para abordar la difícil tarea de caracterizar las propiedades morfológicas, estructurales y químicas de estos agregados, que son difíciles de estudiar utilizando la estructura convencional métodos biofísicos a granel debido a su heterogeneidad y naturaleza transitoria. Los enfoques de microscopía de sonda de escaneo ahora son capaces de investigar la morfología de los agregados amiloide con resolución subnanómetro. Aquí mostramos que la nanoespectroscopia infrarroja (IR) (AFM-IR), que explota simultáneamente la alta resolución de AFM y el poder de reconocimiento químico de la espectroscopia IR, puede ir más allá y permitir la caracterización de las propiedades estructurales de proteínas y, por lo tanto, ofrecen información sobre los mecanismos de agregación. Dado que el enfoque que describimos se puede aplicar también a las investigaciones de las interacciones de los conjuntos de proteínas con moléculas pequeñas y anticuerpos, puede proporcionar información fundamental para desarrollar nuevos compuestos terapéuticos para diagnosticar o tratar trastornos neurodegenerativos.

Introduction

Más de 40 millones de personas en todo el mundo se ven afectadas actualmente por trastornos neurodegenerativos, como el Alzheimer (AD)1 y las enfermedades de Parkinson (PD)2. En términos más generales, más de cincuenta patologías se asocian a nivel molecular con el desdoblamiento y la agregación de proteínas, un proceso que conduce a la proliferación de agregados de proteínas fibrilares insolubles, conocidos como depósitos amiloide3, 4. Los orígenes moleculares de la neurodegeneración y sus vínculos con los cambios conformacionales proteicos de las proteínas que conducen a la formación de amiloide, sin embargo, siguen sin estar claros, en gran parte debido al alto nivel de heterogeneidad, naturaleza transitoria y nanoescala dimensiones de los agregados patológicos4,5.

Investigaciones de gran éxito de las estructuras proteicas en las últimas décadas se han basado ampliamente en el uso de métodos a granel, incluyendo cristalografía de rayos X, microscopía crioelectrónica y espectroscopia de resonancia magnética nuclear5, 6 , 7 , 8 , 9. Dentro de esta clase de técnicas, la espectroscopia infrarroja (IR) ha surgido como una herramienta analítica sensible para desentrañar las propiedades químicas de sistemas biológicos como las proteínas8. Los métodos IR permiten cuantificar los cambios estructurales secundarios y cuaternarios de proteínas durante su desdoblamiento y agregación. Además, con el fin de descifrar aún más a nivel microscópico los detalles mecanicistas involucrados en los complejos paisajes de energía libre de proteínas durante su agregación, un avance importante ha sido el desarrollo de herramientas químicas cinéticas para extender a caminos de autoensamblaje incluyendo la formación de fibrillas amiloideas5,6,7,10,11,12. Sin embargo, los métodos espectroscópicos a granel proporcionan sólo información media sobre el conjunto heterogéneo de especies presentes en la solución o involucradas en pasos microscópicos específicos, lo que hace que la investigación de las propiedades biofísicas de especies agregadas desafiantes en el nivel de nanoescala13,14.

Varias técnicas de microscopía con la capacidad de operar en escalas más pequeñas que el límite de difracción de luz han surgido en las últimas décadas. Esta clase de métodos incluye microscopía electrónica (EM) y microscopía de fuerza atómica (AFM). Mientras que la microscopía electrónica de barrido (SEM) y la microscopía electrónica de transmisión (TEM) proporcionan imágenes bidimensionales (2D) de una muestra, AFM ha surgido en las últimas décadas como una técnica poderosa y versátil para estudiar morfologías tridimensionales (3D), como morfologías tridimensionales (3D), como así como las propiedades nanomecánicas de una muestra con resolución subnanómetro13,14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. La razón de ser del estudio de la agregación de proteínas a través de AFM es que este enfoque permite la investigación de la morfología de las especies individuales presentes en la solución13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. En particular, mediante el seguimiento de la muestra en función del tiempo, AFM permite la investigación de la evolución de la morfología de la especie dentro de la muestra, lo que permite seguir y visualizar las vías de formación de amiloide23, 25,38,39,40,41,42. Además, AFM permite la cuantificación de parámetros estructurales como las alturas transversales y longitudes de las especies individuales presentes en la solución13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48. Sin embargo, el estudio de una sola propiedad biofísica, como la morfología, a menudo no es suficiente cuando se estudian sistemas biológicos heterogéneos y complejos. Los métodos de imágenes AFM, SEM o TEM por sí solos no revelan fácilmente las propiedades químicas de las especies heterogéneas de agregados amiloide a nanoescala.

Recientemente se ha realizado un importante avance para el análisis de muestras biológicas heterogéneas a esta escala con el desarrollo y la aplicación en el campo de la agregación proteica de la nanoespectroscopia infrarroja (AFM-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. Este innovador método aprovecha la combinación de la resolución espacial de AFM (1 x 10 nm) con el poder de análisis químico de IR. La técnica AFM-IR se basa en la medición del efecto de resonancia inducida fototérmica impulsada por un láser IR, y en la medición de la expansión térmica de la muestra bajo investigación por la punta del AFM. La muestra puede ser iluminada por el láser IR directamente desde la parte superior o desde la parte inferior en la reflexión interna total, de forma similar a la de la espectroscopia infrarroja convencional24,42,52,53 . El láser IR se puede pulsada con frecuencias típicas en el orden de cientos de kilohercios (1-1000 kHz) y sintonizado en un amplio rango espectral, típicamente entre 1000-3300 cm-1. Aunque la fuente láser cubre un área de 30 m de diámetro, la resolución espacial de la técnica AFM-IR está determinada nominalmente por el diámetro de la punta AFM, que detecta la expansión térmica local del sistema. AFM-IR es muy adecuado para estudiar muestras biológicas porque la señal IR es proporcional a su espesor de hasta 1 x 1,5 m, y los espectros IR resultantes son generalmente de acuerdo con los espectros de transmisión FTIR correspondientes13,54 ,55. Por esta razón, los métodos establecidos de análisis en espectroscopia se pueden aplicar fácilmente, como el estudio de los cambios químicos, el cambio de forma de la banda y la desconvolución mediante el análisis de derivados segundo52. En general, combinando la resolución espacial de AFM con el poder de reconocimiento químico de la espectroscopia IR, AFM-IR permite la adquisición simultánea de una amplia gama de propiedades morfológicas, mecánicas y químicas de una muestra a nanoescala.

Aquí, ilustramos un protocolo para la caracterización del proceso de agregación de proteínas que explota la combinación de ensayos de fluorescencia in vitro, imágenes AFM de alta resolución y AFM-IR a nanoescala. Este enfoque combinado ya ha sobresalido en proporcionar resultados detallados en el estudio de las propiedades químicas y estructurales de las microgotas individuales formadas por agregados proteicos, en el estudio de la separación de fase sin proteínas líquidas y líquidas, y en investigando la heterogeneidad y las propiedades biofísicas de las especies agregadas individuales a la nanoescala23,26,38,45,50,53, 56,57.

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Protocol

1. Ensayos de agregación en lectores de placas de fluorescencia

NOTA: El protocolo descrito aquí es un ejemplo de cómo estudiar la agregación de cualquier proteína o péptido por cinética química. En particular, describe un protocolo optimizado para estudiar la agregación del péptido A-42, que participa en la aparición y progresión de la enfermedad de Alzheimer58,59. Un protocolo similar puede ser ajustado y adoptado para estudiar la agregación de cualquier proteína o péptido.

  1. Obtener una solución monomérica altamente pura de A-42 a través de técnicas de cromatografía de intercambio iónico y de exclusión de tamaño para distinguir las fracciones proteicas que contienen A-42, y para aislar la fracción monomérica de otras formas agregadas de A-42 obtenidas58 , 59.
  2. Diluir el péptido A-42 en tampón de fosfato sódico de 20 mM, 200 m de EDTA a pH 8,058 a una concentración final deseada que oscila entre 1 x 5 m, en tubos de baja unión de 1,5 ml. Las muestras recogidas para las mediciones de AFM no deben contener el tinte fluorescente utilizado en el ensayo de agregación (thioflavin T, ThT), ya que podría introducir artefactos durante la deposición de la muestra para el análisis de AFM. Por lo tanto, preparar los triplicados de dos soluciones idénticas: i) la primera que contiene A-42 monomérico para seguir el proceso de agregación por AFM; ii) el segundo que contiene el A-42 monomérico con adición de 20 M ThT como trazador para monitorear la cinética de la agregación.
    NOTA: Es importante realizar los pasos 1.1 y 1.2 sobre hielo. Este procedimiento es para asegurarse de que la solución monomérica A-42 no se agrega hasta que se inicie en el lector de placas. Al manipular muestras, el pipeteo cuidadoso es esencial para evitar la introducción de burbujas de aire que puedan afectar a la muestra de proteínas.
  3. Pipetear 80 l de cada muestra en cada pocal de una placa de 96 pocillos y media superficie de poliestireno negro con superficies de fondo transparente y no vinculantes.
  4. Sellar la placa con una lámina para minimizar la evaporación de la muestra en el transcurso de la agregación.
  5. Equilibrar la temperatura del lector de placas a 37oC.
  6. Configurar el protocolo de agregación para leer mediciones de fluorescencia a intervalos de tiempo fijos, a una longitud de onda de excitación de 440 nm y una longitud de onda de emisión de 480 nm. La agregación debe iniciarse en condiciones de reposo.
  7. Inserte la placa en el lector de placas.
    NOTA: Es importante tener cuidado al manipular la placa, para asegurarse de que la agregación no se activa antes de iniciar el lector de placas. Utilice los ajustes de ajuste de ganancia para garantizar la lectura óptima de la fluorescencia de cada muestra.
  8. Inicie la medición.
    NOTA: El experimento de agregación concluye cuando la curva sigmoidal de fluorescencia ThT alcanza una meseta58.

2. Preparación de muestras para mediciones de AFM y nano-IR

  1. Pegue el disco de mica V1 de grado de alta calidad al disco magnético de acero inoxidable de alta calidad utilizando pestañas adhesivas o cinta adhesiva de doble cara.
  2. Etch mica colocando un trozo de cinta adhesiva en la superficie de la mica y tirando de la capa superior de la mica. Este procedimiento producirá una superficie limpia, atómicamente plana, adecuada para la deposición de la muestra.
    NOTA: La superficie grabada debe ser uniforme y lisa.
    ADVERTENCIA: No toque ni respire directamente sobre la mica recién grabada, ya que esto introducirá artefactos.
  3. Pausar/detener la medición del lector de placas para recoger el punto de tiempo de interés durante el proceso de agregación de la proteína.
  4. Retire la lámina de sellado y recoja la alícuota de 10 ml de las muestras sin ThT del pozo en tubos de baja unión de 1,5 ml.
  5. Deposite los 10 s de la muestra en la mica recién grabada. Para las mediciones AFM-IR, las muestras deben depositarse en sustratos de oro recién despojados.
  6. Incubar la solución en la mica durante 1 min para permitir la fisisorbción.
    NOTA: Un tiempo de incubación más largo permitiría una mejor absorción en la superficie, pero puede inducir la autoorganización artificial y el autoensamblaje25. Para evitar estos efectos, la deposición por pulverización puede ser explotada25.
  7. Enjuagar tres veces con 1 ml de agua ultrapura.
  8. Secar bajo un suave flujo de nitrógeno para medir la muestra en el ambiente del aire.

3. Imágenes AFM de la morfología de los agregados proteicos

NOTA: Las mediciones de morfología se pueden realizar tanto en modo de contacto como dinámico, en los pasos siguientes se describe este último ya que reduce las fuerzas laterales para medir la morfología 3D de la muestra con alta resolución. Las mediciones AFM-IR se realizarán en modo de contacto para mejorar la relación señal-ruido AFM-IR.

  1. Encienda el sistema AFM al menos 30 minutos antes de las mediciones para permitir que el sistema alcance la estabilidad térmica. Haga clic en Configuracióny, a continuación, en Sondeo. En la ventana Cambio de sonda haga clic en Siguiente para preparar Z, Etapa de enfoque.
  2. Apague el interruptor de haz AFM (si está encendido). Desbloquee los bloqueos de cola de milano, desconecte la cabeza del sistema y en la ventana Cambio de sonda haga clic en Siguiente.
  3. Monte el voladizo AFM en el soporte de la sonda. Conecte la cabeza al sistema y bloquee los bloqueos de cola de milano.
    NOTA: Los voladizos óptimos para estudiar muestras biológicas en modo dinámico AFM tienen constante de resorte que oscila entre 2 x 40 N m-1 y radios de ápice que oscilan entre 2 x 8 nm14.
  4. Encienda el interruptor de haz láser AFM y en la ventana Cambio de sonda haga clic en Siguiente.
  5. En la ventana emergente haga clic en No si el tipo de voladizo no ha cambiado. Ajuste las perillas de alineación óptica para encontrar el voladizo. Ajuste el enfoque en el voladizo y haga clic en Siguiente.
  6. En la ventana emergente haga clic en Sí si el foco está en el voladizo.
  7. Coloque el rayo láser al final del voladizo utilizando las perillas que controlan la posición del láser de detección. Maximice la señal total medida por el fotodiodo de cuatro cuadrantes a por lo menos >1 V utilizando las perillas que controlan la posición del rayo láser desviado en el fotodiodo sensible a la posición (PSPD). En la ventana Cambio de sonda haga clic en Siguiente y luego en Cerrar.
  8. Espere 15 minutos hasta que el voladizo alcance la estabilidad térmica. Reajuste la posición del rayo láser desviado en el PSPD si es necesario.
  9. Haga clic en NCM SWEEP,elija la amplitud deseada de la oscilación, haga clic en Usar fase,haga clic en auto y ajuste el voladizo cerca del máximo de su primera resonancia libre de oscilación, que es de aproximadamente 300 kHz para un voladizo con una constante de resorte de 40 N m-1.
    NOTA: Ajustar el voladizo fuera del máximo de su resonancia libre asegura una mayor estabilidad de las mediciones14.
  10. Coloque la muestra en el soporte de la muestra. Elija los parámetros de imagen adecuados. La velocidad de escaneo típica es de 0,3 a 1,0 Hz para un área de escaneado de 1 x 1 m2 a 5 x 5 m2. La resolución típica necesaria es entre 256 x 256 y 1024 x 1024 píxeles. Haga clic en Scan Area (Zona de escaneado) para elegir el tamaño del escaneado y el número de píxel.
  11. Enfoque la vista óptica en la muestra. Haga clic en Acercarse para acercarse a la superficie de muestra. Una vez que se haya completado el enfoque, haga clic en Levantar 100 m para elevar la punta de AFM 100 m por encima de la superficie de la muestra. Haga clic en Expandir en la imagen óptica de la muestra. Haga clic en la barra Desenfoque del escenario para centrar la vista en la superficie de la muestra.
  12. Utilice las flechas para desplazarse por la región de la muestra de interés. Encienda la superficie pulsando el botón Enfoque. Haga clic en el botón Escaneo de línea y compruebe si la punta está siguiendo bien la superficie, si es necesario, ajuste el Punto de Ajuste.
  13. Comience a tomar imágenes de la superficie de la muestra pulsando el botón Escanear. Durante la toma de imágenes, para evitar una gran fuerza de imagen y mantener la consistencia de las muestras independientes, mantenga un régimen constante de cambio de fase que no supere los 20o42.
  14. Escriba el nombre del archivo y elija el directorio base donde se guardará la imagen adquirida.

4. Mediciones de nanoespectroscopia infrarroja de agregados proteicos

  1. Encienda el sistema AFM-IR y el láser infrarrojo (IR)60 30-60 min antes de las mediciones para la estabilización térmica. Los láseres típicos para los instrumentos AFM-IR son osciladores de parámetros ópticos (OPO) y láseres de cascada cuántica (QCL).
  2. Abra el software incorporado para controlar el instrumento. Haga clic en el archivo y luego en nuevo para abrir un nuevo archivo nanoIR. Pulse el botón inicializar para iniciar el sistema AFM-IR.
  3. Abra la cubierta del instrumento y monte en el sistema AFM-IR una sonda recubierta de oro de silicio con un radio nominal de 30 nm y una constante de resorte de 0,2 N/m para medir la muestra en modo de contacto.
  4. Haga clic en Cargar en la sección Sonda AFM y luego en siguiente. En foco en la sección de la sonda haga clic en las flechas para enfocar la cámara en el voladizo. En la sección Movimiento XYde la muestra , utilice las flechas para colocar el aire cruzado al final del voladizo.
  5. Gire las perillas que controlan la posición del láser de detección para colocar el láser al final del voladizo. Gire las perillas láser para detectar y maximizar la suma medida por el fotodiodo de cuatro cuadrantes a un valor > 3 V. Gire la perilla de desviación para ajustar la desviación del voladizo a -1 V y luego haga clic en siguiente. Cierre la cubierta del instrumento.
  6. En la sección, el foco en la muestra, utilice las flechas para enfocar la cámara en la muestra. A continuación, en la sección de muestra Movimiento XY utilice las flechas para moverse en la región de interés de la muestra y haga clic en acercarse y participar.
  7. En la ventana del microscopio seleccione como entradas los canales de interés para asignar las propiedades biofísicas de la muestra. En particular, elija la altura para la morfología, la amplitud 2 para la absorción iral y la frecuencia PLL para mapear la resonancia de contacto de la muestra de punta.
  8. En la sección de escaneo AFM de la ventana de controles, utilice parámetros similares a los de la sección 3 (es decir, velocidad de escaneo 0,1 a 1,0 Hz, entre 256 x 256 y 1024 x 1024 píxeles). Elija como valor de las ganancias de acuerdo con la rugosidad de la muestra: Integral I - 1-10 y P proporcional a 10-30. A continuación, haga clic en escanear para adquirir un mapa de morfología.
    NOTA: La morfología se puede medir de forma similar en el modo de roscado dinámico, pero las mediciones AFM-IR se realizan aquí en el modo de contacto para tener relaciones señal/ruido más altas.
  9. Una vez finalizada la cartografía de la morfología, en la ventana del microscopio, haga clic en el mapa de altura para colocar la sonda en la parte superior de un agregado. A continuación, en la sección nanoIR de la ventana de controles, haga clic en iniciar IR para iluminar la muestra con el láser IR.
  10. Para enfocar el láser infrarrojo en el voladizo, haga clic en la optimización. En esta ventana, escriba un número de onda donde la muestra va a tener alta absorbancia y haga clic en agregar. Para la proteína, un valor típico es 1655 cm-1. Haga clic en escanear para encontrar la posición del láser IR y haga clic en actualizar para alinear su posición con el voladizo. Cierre la ventana.
  11. En la sección general de la configuración de nanoIR, escriba un número de onda donde se espera una alta absorbancia en el campo relativo. A continuación, desactive la opción Filtro de paso de banda y mire la lectura del medidor y la transformación rápida de Fourier (FFT) de la respuesta en voladizo. En la ventana FFT mueva el cursor verde para leer la frecuencia de resonancia del voladizo. Un valor típico de la FFT de la resonancia de los voladizos es de alrededor de 300 kHz. Escriba este valor de frecuencia de resonancia en la sección general del campo central freq. y utilice una ventana de frecuencia de 50 kHz.
    NOTA: Seleccione una potencia láser lo suficientemente baja como para no saturar la lectura del medidor y para tener distorsión en la respuesta en voladizo y no sobrecalentar la muestra.
  12. Haga clic en la ventana de sintonización de pulsos láser para utilizar el modo de resonancia mejorada. Elija un centro de frecuencia de 300 kHz, un rango de sintonía de 50 kHz y un ciclo de trabajo del láser del 5%. Haga clic en adquirir para barrer la frecuencia de pulso del láser. Mediante el uso del cursor en el gráfico, ajuste el pulso láser a la frecuencia de la respuesta mecánica de la expansión térmica de la muestra absorbiendo la luz IR. A continuación, seleccione la opción PLL para supervisar la resonancia de contacto entre la muestra y la punta. Pulse el botón cero en la ventana PLL y marque enable para realizar un seguimiento de la resonancia de contacto de la punta de muestra. Elija una ganancia integral I a 0,5 y una ganancia proporcional P a 10. Cierre la ventana.
  13. Abra de nuevo la ventana de optimización y encuentre la posición del láser IR para al menos 3 números de onda correspondientes a las principales bandas de absorción de la muestra (banda de amida I-II-III) y para al menos un número de onda para cada chip del láser.
  14. Haga clic en Herramientas ( Tools) Calibración de fondo IR (IR Background Calibration) Nuevo. En la ventana seleccione la región espectroscópica de interés (1800-1200 cm-1 para estudiar muestras de proteínas); elegir la misma frecuencia de pulso según lo determinado en el paso 4.12 y un ciclo de trabajo del 5%; haga clic en la adquisición rápida y seleccione la velocidad del láser, rango típico para un láser de cascada cuántica está entre 20 x 500 cm-1. Haga clic en adquirir para medir el fondo del láser IR. Este espectro de fondo se utilizará para la normalización de espectros localizados medidos a nanoescala. Cierre la ventana.
    NOTA: Si un modo de láser rápido y resonancia mejorada no está disponible, omita el paso 4.12 y seleccione espectros escalonados en lugar de rápido en las ventanas de adquisición de espectros de fondo e IR. Sin embargo, no se alcanzará la sensibilidad agregada única.
  15. En los ajustes de espectros IR, elija una resolución de espectro IR entre 1 x 4 cm-1 y un número de copromedioes de al menos 64x. Haga clic en adquirir para medir un espectro IR localizado a nanoescala en el rango de proteínas (1800-1200 cm-1).
  16. Para adquirir un mapa químico resuelto a nanoescala, seleccione la opción de imágenes IR, elija un número de onda de interés (por ejemplo, 1655 cm-1 para la banda de amida I) y haga clic en escanear en la ventana de exploración AFM.
  17. Una vez completada la asignación, vaya al archivo y guarde las medidas. Para analizar los mapas adquiridos de morfología, resonancia de contacto y química, así como los espectros localizados a nanoescala, utilice el software de procesamiento de imágenes AFM incorporado. Spectra e Images se pueden guardar como archivos .csv o .axz para un análisis más detallado con software comercial.

5. Procesamiento y análisis de imágenes de dimensiones transversales

  1. Aplanar imágenes en bruto14,17,19,41,42,59 utilizando software de procesamiento de imágenes AFM incorporado o software comercial.
    NOTA: Los agregados deben enmascararse del cálculo para evitar artefactos de análisis y subestimación de su altura medida.
  2. Aplanar la imagen por 0 orden plano ajuste de resta.
  3. Aplanar la imagen por plano y, a continuación, línea por línea en un orden de regresión de1o, el segundo paso se repite hasta que se alcanza la línea base plana en el perfil de línea de la imagen.
  4. Si la muestra está muy concurrida, contiene agregados excepcionalmente altos o el artefacto de arco del escáner está presente, aplanar la imagen usando2nd regression order fit.
  5. Mida la altura y la anchura agregadas a partir de un perfil de línea perpendicular al eje fibril14,17,19,41,42,59.
  6. Mida la longitud de fibrilación paralela al eje fibril14,17,19,41,42,59.

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Representative Results

En la Figura 1se muestra un curso de tiempo representativo de la agregación A-42, medido por el ensayo de fluorescencia ThT. El proceso de agregación se caracteriza comúnmente por una curva sigmoidal, donde se observa inicialmente una fase de retraso, y es seguida por una fase de crecimiento pronunciada, antes de que la curva alcance una meseta cuando se alcanza un estado estacionario de equilibrio6,7 , 58. Es esencial asegurarse de que se utiliza un protocolo de agregación optimizado para generar datos de alta calidad para estudiar los detalles moleculares relativos a los procesos de agregación58.

La alta resolución de AFM permite investigar la morfología y heterogeneidad de las especies agregadas en diferentes puntos de tiempo del proceso. Durante la agregación, supervisada por el ensayo ThT, las alícuotas de la muestra en las placas se preparan para la investigación global única por AFM y nano-IR (Figura 1). El flujo de proceso típico de la preparación manual de la muestra se muestra en la Figura 2. Al finalizar la medición de la morfología 3D de la muestra por AFM de alta resolución y controlado por fases, los mapas se aplanan para eliminar la no linealidad del escáner piezoeléctrico y reducir las fuentes de error en el análisis posterior al procesamiento de la muestra morfología(Figura 3). Posteriormente, se puede realizar un análisis estadístico preciso y sensible de una sola molécula, como se muestra en la Figura 4. A partir de un mapa morfológico 3D, es posible extraer la altura, anchura y longitud transversales agregadas (o diámetro en caso de partículas esferoidales), lo que permite distinguir y caracterizar especies distintas de agregados presentes durante el tiempo de agregación curso23,38. Los puntos de tiempo típicos de interés para investigar el proceso de agregación son la fase de retraso, la fase de crecimiento y la fase de meseta(Figura 1). Durante la fase de retraso, las especies monoméricas y oligoméricas de A-42 están presentes principalmente. Cuando se visualiza n.o de aFM, las especies monoméricas y oligoméricas de A-42 suelen aparecer como partículas esferoidales de 1 a 15 nm de diámetro y 0,3 x 2 nm de altura(Figura 1, abajo a la izquierda)38,39. La formación de protofilamentos alargados, protofibrillas y fibrillas es visible durante la fase de crecimiento del curso de tiempo de agregación A-42(Figura 1, medio inferior)38,39. Típicamente, los protofilamentos aparecen como características alargadas de cientos de nanómetros de longitud y 0,5 x 2 nm de altura, mientras que los protofibrillas aparecen como agregados lineales o curvilíneas alargados de 1 a 5 nm de altura y cientos de nanómetros de longitud38, 39. Durante la fase de meseta, las fibrillas son las especies dominantes de los agregados A-42. Las fibrillas A-42 suelen aparecer como estructuras no ramificadas, similares a hilos, con un diámetro transversal de 6 x 10 nm y longitud en el orden si micrómetros(Figura 3, abajo a la derecha)38,39. Sorprendentemente, esta representación esquemática de las propiedades morfológicas de los agregados es una característica general de la mayoría de las proteínas y péptidos gregantes13,14.

Después de la investigación de la morfología de la muestra, el nano-IR se puede utilizar para investigar las propiedades químicas de las especies de agregados de proteínas individuales presentes durante el proceso de agregación, mediante la adquisición de mapas IR resueltos a nanoescala y espectros tanto en el aire como en ambiente líquido nativo24,26,38,4249,50,51,52,. La Figura 5 muestra una ilustración esquemática de la configuración de AFM-IR. Una fuente IR se utiliza para iluminar la muestra desde la parte inferior en la reflexión interna total o directamente desde la parte superior como en la Figura 5a. Si la luz IR es absorbida por la muestra, excitará los niveles de transición de energía vibratoria molecular correspondientes de la especie presente. La energía vibratoria se disipa dentro de la muestra en forma de calentamiento térmico, lo que provoca la expansión térmica de la muestra. Esta expansión se mide a nanoescala por la punta AFM en contacto con la muestra con una resolución en el orden de 10 nm. En cada pulso, el voladizo detecta la expansión térmica. En particular, la rápida expansión de la muestra expulsa al voladizo del contacto con la muestra, y después de la patada el voladizo suena hacia abajo en sus frecuencias naturales. Con el fin de mejorar la sensibilidad de AFM-IR, es posible ajustar la frecuencia de pulso láser a la misma frecuencia de la oscilación del voladizo54. Para trabajar en este modo mejorado por resonancia, es necesario tener fuentes IR que se pueden pulser en una amplia gama de frecuencias, tales como láseres de cascada cuántica que operan típicamente en un rango entre 1-1000 kHz. La amplitud de pico a pico y la transformación rápida de Fourier de la señal de timbre, que se denomina amplitud IR, de la desviación en voladizo en bruto son proporcionales a la luz IR absorbida. Estas señales se detectan en tiempo real midiendo la desviación de un láser rojo centrado en la parte superior del voladizo. Para adquirir mapas químicos, el número de onda láser se fija en un determinado número de onda y la señal de amplitud IR se recoge en cada punto del mapa, mientras que, para adquirir espectros IR, la posición del voladizo se fija en una posición de interés y el láser longitud de onda se barre a lo largo del rango espectroscópico de interés. La resolución final de AFM-IR permite la medición de las propiedades químicas de los agregados proteicos con una altura transversal de aproximadamente 5 nm, como se representa en la Figura 6.

Figure 1
Figura 1: Monitoreo del curso de tiempo de agregación in vitro a través de fluorescencia ThT y AFM.
Las muestras tomadas durante la fase de retraso, la fase de crecimiento y la fase de meseta del proceso de agregación detectada por la fluorescencia ThT se tomaron imágenes a través de AFM de alta resolución. Esta figura ha sido adaptada de Ruggeri et al.38. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Representación esquemática de la preparación del sustrato y deposición de la muestra para mediciones de AFM.
(A, B) Grabado de mica con cinta adhesiva. (C) Deposición de muestra. (D) Incubación de muestras. (E) Muestra de enjuadeado con agua ultrapura. (F) Secado de muestras bajo un flujo suave de nitrógeno. (G) Imágenes de muestra utilizando voladizo AFM microfabricado con punta afilada en su extremo. (H) Imagen procesada de fibrillas amiloideas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Procedimiento de procesamiento de imágenes AFM42.
La parte superior de cada panel muestra una línea de perfil de la superficie de muestra (línea roja) ilustrada por la imagen AFM correspondiente, mientras que la parte inferior muestra un histograma de la altura de todos los píxeles de la imagen. (a ) Imagen AFM sin procesar antes del procedimiento de aplanamiento de la imagen. (b) Imagen AFM después del procedimiento de procesamiento utilizando todo el plano de aplanamiento. Las estructuras fibrilas (color rosa) se enmascararon del procedimiento de aplanamiento. (c) Imagen procesada mediante el procedimiento de aplanamiento línea por línea. (d) Imagen final después del procedimiento de procesamiento de imágenes. Esta figura ha sido adaptada de Ruggeri et al.42.

Figure 4
Figura 4: Análisis estadístico agregado único de imágenes AFM.
(a ) Ejemplo del trazado de las alturas y longitudes de las estructuras fibrilas, indicado con 1 y 2. (b) Gráfico con secciones de las fibrillas trazadas y su altura media. (c) Ejemplo de un histograma que muestra la altura media de las estructuras fibrilares. (d) Gráfico con perfil normalizado de las fibrillas trazadas 1 y 2. (e) Distribución del histograma de los puntos de altura del perfil normalizado. Esta figura ha sido adaptada de Ruggeri et al.42. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Principio de función del método AFM-IR.
(a) La luz IR absorbida provoca la expansión térmica de la muestra, excitando las resonancias mecánicas del voladizo AFM en contacto con la muestra. La amplitud de las oscilaciones en voladizo es proporcional a la absorción IR. (b) Los mapas de absorción IR se obtienen escaneando el voladizo en la muestra mientras se fija la longitud de onda láser. (c) La punta y la muestra en contacto se comportan como un sistema de muelles acoplados cuya frecuencia resonante aumenta monotonónicamente con la rigidez intrínseca de la muestra50. (d) Los espectros localizados se obtienen barriendo la longitud de onda del láser mientras se fija la posición del voladizo AFM. (e) Espectro IR de proteínas. (f) En resumen, AFM-IR permite el estudio simultáneo de las propiedades morfológicas, mecánicas y químicas a la nanoescala26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Nanoespectroscopia infrarroja (nano-IR) de un único agregado amiloide.
(a ) Mapa morfológico de AFM. (b) Mapa de absorción IR en el pico de resonancia láser a 1658 cm-1. (c) Dimensiones transversales de la altura de la fibrila. (d) espectros IR en diferentes posiciones de la estructura fibrilar (marcada en el panel b con círculos azules) y el sustrato (marcado en el panel b con círculos verdes). La señal neta media derivada de la estructura agregada (línea negra sólida) se obtuvo restando la señal de fondo promediada (línea verde sólida) de la señal de fibrilla media (línea azul sólida). Esta figura ha sido adaptada de Ruggeri et al.42.

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Discussion

El primer paso crítico en este protocolo es la preparación de proteínas monoméricas, como en el caso de la solución A-42 descrita en los pasos 1.1 y 1.2. Es esencial iniciar el proceso de agregación a partir de una solución monomérica altamente pura, ya que la presencia de especies oligoméricas o agregadas puede dar lugar a una mala reproducibilidad de la cinética de agregación58,e inducir artefactos en el AFM medidas (por ejemplo, especies fibrilares serán evidentes en las etapas iniciales de la agregación), lo que puede conducir a la interpretación errónea de los datos. Los datos cinéticos altamente reproducibles de la formación de amiloides basados en el ensayo de fluorescencia ThT, en asociación con el formalismo de la ecuación maestra de la cinética química5,6,7, han permitido definir la agregación A-42 en términos de sus eventos moleculares subyacentes. La cinética química conecta los pasos microscópicos subyacentes a la formación de amiloide con sus manifestaciones macroscópicas considerando las diferentes formas en que los nuevos agregados pueden formarse y crecer, que son, por ejemplo, el alargamiento en los extremos agregados o secundarios nucleación en la superficie agregada. Sin embargo, la cinética química por sí misma no permite directamente la visualización de los posibles fenómenos de nucleación a la nanoescala que requieren su combinación con métodos de molécula única.

El segundo paso crítico en este protocolo es la preparación del sustrato y los procedimientos de deposición de muestras descritos en los pasos 2.2 y 2.6-2.8. Para evitar artefactos, la muestra debe depositarse en una superficie limpia y atómicamente plana. El grabado adecuado de la mica es esencial para lograr una alta resolución libre de artefactos en las mediciones de AFM. El tiempo de deposición de la muestra también es extremadamente importante, ya que un tiempo de incubación más largo permite una mejor absorción en la superficie del sustrato. Sin embargo, también podría inducir la autoorganización artificial y el autoensamblaje25, que pueden inducir artefactos (por ejemplo, especies agregadas inducidas por la superficie) que pueden conducir a una mala interpretación de los datos. Además, la superficie de mica se carga negativamente, lo que significa que sólo las moléculas cargadas positivamente se absorben fácilmente en ella. Si la carga neta de la muestra es negativa, la superficie de la mica se puede funcionalizar positivamente utilizando APTES para una mejor phisisorción23. La deposición microfluídica de pulverización25 puede ser explotada para evitar estos efectos y artefactos y depositar la muestra de una sola manera y libre de artefactos.

El tercer paso crítico es la configuración adecuada y la elección de parámetros de imagen para la toma de imágenes de muestra a través de AFM y AFM-IR descritos en la sección 3. Las puntas de AFM utilizadas para la toma de imágenes de muestra deben ser lo suficientemente nítidas (radios de ápice de 2 a 8 nm) para lograr una alta resolución y minimizar los efectos de convolución (ampliación de las características de la muestra por la punta)14,lo que puede inducir incertidumbres en la imagen de la muestra. La elección del modo de imagen, contacto o dinámico, también es importante. Para las imágenes de muestra a través de AFM convencional, se prefiere el modo dinámico sobre el modo de contacto, ya que este último modo induce grandes fuerzas de fricción de la muestra lateral de la punta que pueden causar daños en la muestra e introducir artefactos en las mediciones (por ejemplo, la reducción de la altura de la muestra debido a la nanoindentación)14,61,62. Por el contrario, se prefiere el modo de contacto para las mediciones a través de nano-IR para mejorar la señal AFM-IR. Para las mediciones en modo dinámico, el voladizo debe sintonizarse ligeramente por debajo (modo de toma) o por encima (modo sin contacto) el máximo de su primera resonancia libre de oscilación para asegurar una mayor estabilidad de las mediciones14. La resolución de la imagen, que depende del número de píxeles y el área de escaneado, debe ser lo suficientemente alta como para capturar el menor grado de detalle presente en una muestra (por ejemplo, 1024 x 1024 píxeles para un área de 4 x 4 ám2) 14,63. La baja resolución de imágenes puede inducir distorsiones e incertidumbres en la imagen de la muestra debido a la pérdida de la información vertical y lateral tras la digitalización de la señal14. La velocidad de escaneo, utilizada para la toma de imágenes, debe ser lo suficientemente baja como para que la punta pueda seguir las características de la superficie correctamente, así como para tener tiempo suficiente para adquirir información química14. Uno de los parámetros de imagen más importantes es la fuerza de la toma de imágenes. En el modo de contacto, es fundamental utilizar una fuerza de interacción baja para preservar la estructura de la muestra. En el modo dinámico, la disipación de energía en las muestras debe mantenerse constante para comparar constantemente la morfología de muestras distintas; se pueden obtener imágenes coherentes de muestras independientes manteniendo un régimen constante de un cambio de fase que no exceda de 20o14,42. Se deben evitar grandes fuerzas de imagen, ya que pueden inducir distorsiones e incertidumbres en las imágenes de muestra.

La deriva térmica causada por la expansión y contracción de las piezas AFM debido a fluctuaciones térmicas puede inducir distorsiones y artefactos en la imagen de la muestra64,65. Las derivas en la dirección vertical pueden hacer que el voladizo pierda la pista de la superficie, así como chocar contra la superficie, mientras que las derivas en la dirección lateral suelen dar lugar a un alargamiento de las entidades de la superficie y la distorsión de la imagen, lo que dificulta realizar mediciones precisas de las características de la muestra. El efecto de estas derivas térmicas se puede minimizar mediante un control preciso de la temperatura del laboratorio, así como dando suficiente tiempo (alrededor de 30 min) para que el sistema se vuelva estable o mediante la realización de escaneos rápidos66,67,68 , 69 , 70.

La calidad de la colección de imágenes y espectros nano-IR por AFM-IR puede verse afectada por varios factores, de los cuales los más importantes son: (i) una división incorrecta de la señal IR en la muestra por el fondo IR, (ii) una gran variación del contacto nanomecánico entre la punta y la muestra, y iii) un calentamiento excesivo de la muestra causando su ablandamiento. Para dividir correctamente el espectro IR de la muestra por el fondo recogido, es crucial que se recojan a la misma potencia láser. De hecho, la forma de la línea espectral del fondo del láser IR depende de la potencia del láser. A continuación, con el fin de evitar la influencia de las propiedades mecánicas de la muestra en la información química medida, es crucial monitorear y realizar un seguimiento de la resonancia de contacto entre la muestra y la punta durante la adquisición de espectros y imágenes. Para la adquisición de espectros, idealmente, es suficiente para pulse el láser en una resonancia de contacto fijo. Sin embargo, si el espectro se adquiere en un amplio rango espectroscópico, los picos de alta intensidad podrían causar un fuerte calentamiento de la muestra y su ablandamiento, cambiando así la resonancia de contacto de la muestra de punta y reduciendo artificialmente la amplitud del pico IR. Por esta razón, es importante realizar un seguimiento de la resonancia de contacto durante la adquisición de espectros para verificar que el espectro no se ve afectado por el calentamiento excesivo de la muestra.

En conclusión, el AFM convencional y el nano-IR son capaces de investigar con alta resolución las propiedades morfológicas, estructurales y químicas de las especies individuales que se forman durante la agregación de proteínas24,38. Sin embargo, carecen de la capacidad de la cinética química para seguir su rápida cinética de formación en condiciones nativas a granel. Con el fin de desentrañar los cambios de conformación que sufren las proteínas durante su agregación y desdoblamiento, es necesario desarrollar y aplicar nuevos métodos biofísicos capaces de reunir las capacidades de los métodos biofísicos a granel con el la heterogeneidad y las propiedades ultraestructurales de la agregación de proteínas a nanoescala. Este enfoque representa una vía fructífera para abordar el desafío de entender el problema del autoensamblaje de proteínas y su papel en la salud y la enfermedad. De hecho, los enfoques agregados únicos son capaces de desentrañar y dilucidar los mecanismos moleculares del polimorfismo y la formación de la agregación de proteínas. Esta información es fundamental para abordar el desafío de comprender la agregación de proteínas y su papel en la aparición y progresión de las enfermedades humanas, así como para comprender sus propiedades biofísicas para aplicaciones biotecnológicas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen a Swiss National Foundation for Science (SNF) el apoyo financiero (número de subvención P2ELP2_162116 y P300P2_171219), el Darwin College, el programa Erasmus+ para el apoyo financiero (número de subvención 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) y el programa de apoyo financiero (número de subvención 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) y el programa de subvención la investigación que ha dado lugar a estos resultados ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación en el marco del Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (7PM/2007-2013) a través de la beca PhysProt (acuerdo número 337969), la Fundación Newman (T.P.J.K.) y La Beca PhysProt (acuerdo número 337969), la Fundación Newman (T.P.J.K.) y La Centro de Cambridge para Enfermedades deSdoblamiento (C.G., M.V. y T.P.J.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM-IR system Anasys Instruments nanoIR 2 or 3 Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape Corning 6570
Double Sided Adhesive Discs AGAR Scientific AGG3347N
FLUOstar Omega BMG Labtech 415-101 Platereader
Mica Disc 10mm V1 AGAR Scientific AGF7013
Park NX10 AFM system Park Systems N/A Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips Platypus Technologies AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers Park Systems PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL Eppendorf 30108132
Silicon gold coated cantilevers Anasys Instruments PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm AGAR Scientific AGF7001

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Bioquímica Número 151 amiloide neurodegeneración agregación de proteínas microscopía de fuerza atómica nanospectroscopia infrarroja análisis de molécula única espectroscopia
Caracterización de agregados de proteínas individuales por nanoespectroscopia infrarroja y microscopía de fuerza atómica
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Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Chia, S., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60108, doi:10.3791/60108 (2019).

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