Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Bireysel Protein Agregalarının Kızılötesi Nanospektroskopi ve Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Karakterizeleştirilmesi

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/60108
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry, University of Cambridge, 2Institute of Biotechnology, Life Sciences Center, Vilnius University, 3Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge

Summary

Biz kızılötesi nanospectroskopi ve yüksek çözünürlüklü atomik kuvvet mikroskobu oligomerik agregalar ve amiloid fibrils içine protein kendini montaj sürecini görselleştirmek için uygulama açıklar, yakından başlangıç ve geliştirme ile ilişkilidir insan nörodejeneratif bozuklukların geniş bir yelpazede.

Abstract

Protein yanlış katlama ve toplama olgusu, Alzheimer ve Parkinson gibi nörodejeneratif durumlarla ilişkili yüksek heterojen protein agregalarının oluşumuna neden olur. Özellikle düşük molekül ağırlıklı agregalar, amiloid oligomerler, jenerik sitotoksik özelliklere sahip olduğu gösterilmiştir ve demans birçok formları nörotoksinler olarak karıştığı gösterilmiştir. Konvansiyonel yapısal yöntemlerle incelenmesi zor olan bu agregaların morfolojik, yapısal ve kimyasal özelliklerini karakterize etme gibi zorlu bir görevi ele almak için atomik kuvvet mikroskobu (AFM) dayalı yöntemlerin kullanımını gösteriyoruz. heterojenlik leri ve geçici doğası nedeniyle yöntemler veya toplu biyofiziksel yöntemler. Tarama sondamikroskopi yaklaşımları artık nanometre çözünürlüğü ile amiloid agregaların morfolojisini araştırma yeteneğine sahiptir. Burada, AFM'nin yüksek çözünürlüğünü ve IR spektroskopisinin kimyasal tanıma gücünü aynı anda kullanan kızılötesi (IR) nanospektroskopinin (AFM-IR) daha ileri gidebileceğini ve bireyin yapısal özelliklerinin karakterizasyonunu mümkün kılabilir. protein agregaları, ve böylece toplama mekanizmaları içine anlayışlar sunuyoruz. Tarif ettiğimiz yaklaşım, protein derlemelerinin küçük moleküller ve antikorlarla etkileşimlerinin araştırılmasına da uygulanabildiği için, tanı veya tedavi etmek için yeni terapötik bileşikler geliştirmek için temel bilgiler sunabilir. nörodejeneratif bozukluklar.

Introduction

Dünya çapında 40 milyondan fazla insan şu anda nörodejeneratif bozukluklar etkilenir, Alzheimer gibi (AD)1 ve Parkinson (PH)2 hastalıkları. Daha genel olarak, elliden fazla patoloji protein misfolding ve agregasyon ile moleküler düzeyde ilişkilidir, çözünmez fibriller protein agregalarının çoğalmasına yol açan bir süreç, amiloid mevduat olarak bilinen3, 4. Nörodejenerasyonun moleküler kökenleri ve amiloid oluşumuna yol açan proteinlerin protein konformasyonel değişiklikleri ile bağlantıları, ancak, heterojen yüksek düzeyde nedeniyle büyük ölçüde belirsiz liğini koruyor, geçici doğa ve nanoölçek patolojik agregaların boyutları4,5.

Son birkaç on yıl içinde protein yapıları son derece başarılı araştırmalar x-ışını kristalografisi, kriyo-elektron mikroskobu ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi 5 dahil olmak üzere toplu yöntemlerin kullanımı, yaygın olarak dayanmaktadır5, 6.000 , 7.000 , 8.000 , 9. Teknikleri bu sınıf içinde, kızılötesi (IR) spektroskopi proteinler 8 gibi biyolojik sistemlerin kimyasal özelliklerini çözmek için hassas bir analitik araç olarak ortayaçıkmıştır. IR yöntemleri, protein sekonder ve kuaternary yapısal değişikliklerin yanlış katlama ve toplama sırasında nicelleştirilmesine olanak sağlar. Buna ek olarak, mikroskobik düzeyde daha fazla şifreyi çözmek için onların toplama sırasında protein karmaşık serbest enerji manzara dahil mekanistik ayrıntıları, önemli bir ilerleme karmaşık genişletmek için kimyasal kinetik araçların geliştirilmesi olmuştur amiloid fibrilsoluşumu5,6,7,10,11,12dahil olmak üzere kendi kendine montaj yolları . Ancak, toplu spektroskopik yöntemler, çözeltide bulunan veya belirli mikroskobik adımlarda yer alan türlerin heterojen topluluğu hakkında sadece ortalama bilgi sağlayarak bireyin biyofiziksel özelliklerinin araştırılmasını sağlar. nanoölçekli düzeyde zorlu toplu türler13,14.

Son yıllarda ışığın kırınım sınırından daha küçük ölçeklerde çalışma kapasitesine sahip çeşitli mikroskopi teknikleri ortaya çıkmıştır. Bu yöntem sınıfı elektron mikroskobu (EM) ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) içerir. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve iletim elektron mikroskobu (TEM) bir numunenin iki boyutlu (2D) görüntülerini sağlarken, AFM son yıllarda üç boyutlu (3D) morfolojileri incelemek için güçlü ve çok yönlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. nanometre çözünürlüğü 13 , 14,15,16,17,18,19, 20.000 , 21.000 , 22.000 , 23.000 , 24.000 , 25.000 , 26.000 , 27- AFM ile protein toplama eğitiminin ardındaki mantık, bu yaklaşımınçözelti13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. Özellikle, zaman bir fonksiyonu olarak örnek izleyerek, AFM mümkün takip etmek ve amiloid oluşumu 23 yollarını görselleştirmek için yapar, örnek içinde türlerin morfolojisi evriminin araştırılmasına olanak sağlar23, 25,38,39,40,41,42. Ayrıca, AFM kesitsel yükseklikleri ve çözelti13mevcut bireysel türlerin uzunlukları gibi yapısal parametrelerin sayısallaştırılması nı sağlar 13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44.000 , 45.000 , 46.000 , 47.000 , 48- Ancak, morfoloji gibi tek bir biyofiziksel özelliğin incelenmesi, heterojen ve karmaşık biyolojik sistemleri incelerken genellikle yeterli değildir. AFM, SEM veya TEM görüntüleme yöntemleri tek başına nano ölçekte amiloid agregalarının heterojen türlerinin kimyasal özelliklerini kolayca ortaya çıkaramaz.

Bu ölçekte heterojen biyolojik örneklerin analizi için önemli bir ilerleme son zamanlarda kızılötesi nanospektroskopi (AFM-IR)24,26protein toplama alanına geliştirme ve uygulama ile yapılmıştır, 38,42,49,50,51,52. Bu yenilikçi yöntem, AFM'nin (~1−10 nm) uzamsal çözünürlüğünün IR'nin kimyasal analiz gücüyle birleşiminden yararlanır. AFM-IR tekniği, IR lazeri tarafından yönlendirilen fototermal rezonans etkisinin ölçümü ve AFM ucu ile araştırılanın camı termal genleşmenin ölçümü üzerine dayanır. Örnek, geleneksel kızılötesi spektroskopi24,42,52,53 gibi, toplam iç yansıma doğrudan üst veya alttan IR lazer ile aydınlatılabilir . IR lazer kilohertz (1−1000 kHz) yüzlerce sırayla tipik frekansları ile darbeli olabilir ve geniş bir spektral aralık üzerinde ayarlanmış, genellikle arasında 1000−3300 cm-1. Lazer kaynağı ~30 μm çapında bir alanı kapsa da, AFM-IR tekniğinin mekansal çözünürlüğü, sistemin yerel ısıgenliğini algılayan AFM uç çapı ile nominal olarak belirlenir. AFM-IR biyolojik numuneleri incelemek için uygundur, çünkü IR sinyali kalınlığı 1−1,5 μm'ye kadar orantılıdır ve ortaya çıkan IR spektrumları genellikle ilgili FTIR iletim spektrumları13,54 ile uyum içindedir ,55. Bu nedenle, spektroskopide yerleşik analiz yöntemleri, kimyasal değişimlerin incelenmesi, bant şekli değişimi ve ikinci türevlerin analizi ile de-kıvrım gibi kolayca uygulanabilir52. Genel olarak, AFM'nin uzamsal çözünürlüğünü IR spektroskopisinin kimyasal tanıma gücüyle birleştiren AFM-IR, nano ölçekte bir numunenin çok çeşitli morfolojik, mekanik ve kimyasal özelliklerinin aynı anda elde edilmesini sağlar.

Burada, in vitro floresan tahlilleri, yüksek çözünürlüklü AFM görüntüleme ve nano ölçekli AFM-IR kombinasyonunu kullanan protein toplama sürecinin karakterizasyonu için bir protokol gösterilmektedir. Bu kombine yaklaşım, protein agregalarının oluşturduğu bireysel mikro damlacıkların kimyasal ve yapısal özelliklerinin incelenmesinde, sıvı-sıvı protein faz ayrıştırma çalışmalarında ve nanoölçekte23, 26,38,45,50,53,bireysel toplu türlerin heterojenite ve biyofiziksel özelliklerini araştırmak , 56,57.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Floresan levha okuyucular üzerinde toplama tahlilleri

NOT: Burada açıklanan protokol, herhangi bir protein veya peptidin kimyasal kinetik ile nasıl toplandığının incelenmesine bir örnektir. Özellikle, Alzheimer hastalığının başlangıcı ve ilerlemesi nde yer alan Aβ42 peptid, agregasyon incelemek için optimize edilmiş bir protokol açıklar58,59. Benzer bir protokol ayarlanabilir ve herhangi bir protein veya peptid toplama çalışma doğru kabul edilebilir.

  1. Aβ42 içeren protein fraksiyonlarını ayırt etmek için iyon değişimi ve boyut dışlama kromatografi teknikleri ile Aβ42'nin son derece saf monomerik çözeltisini elde etmek ve monomerik fraksiyonu Elde edilen Aβ42'nin diğer toplam formlarından ayırmak için58 , 59.
  2. Aβ42 peptidini 20 mM sodyum fosfat tamponunda seyreltin, pH 8.058'de 200 μM EDTA'yı 1−5 μM arasında değişen bir nihai konsantrasyona 1,5 mL düşük bağlamalı tüplerde seyreltin. AFM ölçümleri için toplanan numuneler, AFM analizi için numune birikimi sırasında eserler getirebileceğinden, agregasyon tahlillerinde (tioflavin T, ThT) kullanılan floresan boyayı içermemelidir. Böylece, iki özdeş çözeltinin triplicates hazırlamak: i) Ilk içeren monomerik Aβ42 AFM tarafından toplama sürecini takip etmek; ii) agregasyonk kinetik izlemek için bir izleyici olarak 20 μM ThT ekolarak Aβ42 monomerik içeren ikinci.
    NOT: Buz üzerinde 1.1 ve 1.2 adımlarını gerçekleştirmek önemlidir. Bu yordam, monomerik Aβ42 çözeltisinin plaka okuyucuda başlatılana kadar toplamını sağlamamasını sağlamaktır. Numuneleri işlerken, protein örneğini etkileyebilecek hava kabarcıklarının ortaya çıkmasına karşı dikkatli pipetleme esastır.
  3. Pipet, her bir numunenin her bir kuyuda, açık alt ve bağlayıcı olmayan yüzeylere sahip 96 kuyulu, yarım alanlı siyah polistiren plakası.
  4. Plakayı, numunenin toplama süresince buharlaşmasını en aza indirmek için bir folyo ile kapatın.
  5. Plaka okuyucunun sıcaklığını 37 °C'ye dengeleyin.
  6. 440 nm uyarma dalga boyunda ve 480 nm emisyon dalga boyunda, sabit zaman-nokta aralıklarında floresan ölçümleri okumak için toplama protokolünü ayarlayın. Toplama quiescent koşullarda başlatılmalıdır.
  7. Plakayı plaka okuyucusuna takın.
    NOT: Plaka yı çalıştırmadan önce agregasyonun tetiklenmediğinden emin olmak için plakayı kullanırken dikkatli olmak önemlidir. Her numunenin floresansının en iyi şekilde okunmasını sağlamak için kazanç ayarlama ayarlarını kullanın.
  8. Ölçümü başlatın.
    NOT: ThT floresan sigmoidal eğrisi plato58'eulaştığında toplama deneyi sonuçlandırılır.

2. AFM ve nano-IR ölçümleri için numune hazırlama

  1. Yapıştırıcı sekmeler veya çift taraflı bant kullanarak yüksek kaliteli manyetik paslanmaz çelik diske yapıştırıcı en kaliteli kaliteV1 mika disk.
  2. Mika yüzeyine yapışkan bant bir parça yerleştirerek ve mika üst tabakası çekerek mica etch. Bu işlem, numune birikimine uygun temiz, atomik olarak düz bir yüzey üretecektir.
    NOT: Kazınan yüzey düzgün ve pürüzsüz olmalıdır.
    DİkKAT: Yeni kazınmlı mikanın üzerine doğrudan dokunmayın veya nefes almayın, çünkü bu eserler tanıtacak.
  3. Proteinin toplama işlemi sırasında ilgi çekici zaman noktasını toplamak için plaka okuyucu ölçümünü duraklatın/durdurun.
  4. Sızdırmazlık folyosunun çıkarılmasını ve tht olmadan numunelerin 10 μL aliquot'ünü kuyudan 1,5 mL düşük bağlamalı tüplere toplayın.
  5. Numunenin 10 μL'sini taze kazınan mikanın üzerine yatırın. AFM-IR ölçümleri için numuneler taze soyulmuş altın alt tabakaüzerine yatırılmalıdır.
  6. Fizyorbasyon alabilmek için mikadaki çözeltiyi 1 dk kuluçkaya yatırın.
    NOT: Daha uzun kuluçka süresi yüzeyde daha iyi emilimi sağlayacak ama yapay öz-organizasyon ve kendi kendine montaj neden olabilir25. Bu etkilerden kaçınmak için, sprey birikimi25yararlanılabilir.
  7. 1 mL ultra saf su ile üç kez durulayın.
  8. Hava ortamında numuneyi ölçmek için hafif bir azot akışı altında kurulayın.

3. Protein agregalarının morfolojisinin AFM görüntülemesi

NOT: Morfoloji ölçümleri hem temas hem de dinamik modda yapılabilir, aşağıdaki adımlarda, numunenin 3Boyutlu morfolojisini yüksek çözünürlükte ölçmek için lateral kuvvetleri azalttığı için ikincisi açıklanmıştır. AFM-IR ölçümleri, AFM-IR sinyal-gürültü oranını artırmak için temas modunda yapılacaktır.

  1. Sistemin termal stabiliteye ulaşmasını sağlamak için ölçümlerden en az 30 dakika önce AFM sistemini açın. Kurulum'atıklayın, ardından Probe'da. Sonda Değiştir penceresinde Z, Odak Aşaması'nıhazırlamak için İleri'ye tıklayın.
  2. AFM ışın anahtarını kapatın (açıksa). Güvercin kuyruğu kilitlerini açın, kafanın sistemden bağlantısını kesin ve Sonda Değiştir penceresinde İleri'yetıklayın.
  3. AFM kantilini sonda tutucuya monte edin. Kafayı sisteme bağlayın ve güvercin kuyruğu kilitlerini kilitleyin.
    NOT: Dinamik modda biyolojik numuneleri incelemek için optimal kantileverler 2−40 N m-1 arasında değişen yay sabiti ve 2−8 nm14arasında değişen bir apeks yarıçapına sahiptir.
  4. AFM lazer ışını anahtarını açın ve Sonda Değiştir penceresinde İleri'yetıklayın.
  5. Açılan pencerede cantilever türü değişmediyse Hayır'ı tıklatın. Cantilever'i bulmak için optik hizalama düğümlerini ayarlayın. Cantilever üzerine odak ayarlayın ve İleritıklayın.
  6. Açılan pencerede odak kantilever ise Evet'e tıklayın.
  7. Algılama lazerinin konumunu kontrol eden düğümleri kullanarak lazer ışınını kantilin in sonuna yerleştirin. Konuma duyarlı fotodiyot (PSPD) üzerindeki saptırılmış lazer ışınının konumunu kontrol eden düğümleri kullanarak dört dörtlük fotodiyot ile ölçülen toplam sinyali en az >1 V'a kadar en üst düzeye çıkarın. Sonda Değiştir penceresinde İleri'ye ve ardından Kapat'atıklayın.
  8. Kantilin termal stabiliteye ulaşması için 15 dk bekleyin. Gerekirse PSPD üzerinde saptırılmış lazer ışınının konumunu kolayca hazırlayın.
  9. NCM SWEEPtıklayın, salınım istenilen genlik seçin, Kullanım Aşamasıtıklayın , otomatik tıklayın ve bir yaklaşık 300 kHz olan salınım, ilk ücretsiz rezonans maksimum yakın cantilever ayarlayın 40 N m-1yay sabiti ile cantilever .
    NOT: Kantilin serbest rezonansının maksimumundan çıkarılması, ölçümlerin daha yüksek stabilitesini sağlar14.
  10. Numuneyi numune tutucuya yerleştirin. Uygun görüntüleme parametrelerini seçin. Tipik tarama hızı 1 x 1 μm2 ila 5 x 5 μm2'likbir tarama alanı için 0,3−1,0 Hz'dir. Gerekli tipik çözünürlük 256 x 256 ve 1024 x 1024 piksel arasındadır. Tarayıp boyutunu ve piksel numarasını seçmek için Scan Alanını tıklatın.
  11. Optik görünümü örneğe odakla. Örnek yüzeyine yaklaşmak için Yaklaşım'a tıklayın. Yaklaşma tamamlandıktan sonra AFM ucunu numunenin yüzeyinden 100 μm üzerine çıkarmak için Lift 100 μm'ye tıklayın. Örneğin optik görüntüsünü Genişlet'i tıklatın. Görünümü örnek yüzeyine odaklamak için Odak Aşaması çubuğuna tıklayın.
  12. İlgi örneği bölgesinde hareket etmek için okları kullanın. Yaklaş düğmesine basarak yüzeyi meşgul edin. Line Tcan düğmesine tıklayın ve ucun yüzeyi iyi izleyip takip edip olmadığını kontrol edin, gerekirse Set Noktasınıayarlayın.
  13. Scan düğmesine basarak örnek yüzeyini görüntülemeye başlayın. Görüntüleme sırasında, büyük görüntüleme kuvvetinden kaçınmak ve bağımsız numunelerin tutarlılığını korumak için Δ20°42'yigeçmeyen sabit bir faz değişimi rejimini koruyun.
  14. Dosya adını girin ve edinilen görüntünün kaydedileceği temel dizini seçin.

4. Protein agregalarının kızılötesi nanospektroskopi ölçümleri

  1. Termal stabilizasyon ölçümleri öncesinde AFM-IR sistemini ve kızılötesi (IR)lazer60 30−60 dk'yı açın. AFM-IR cihazları için tipik lazerler optik parametre osilatörleri (OPO) ve kuantum basamaklı lazerlerdir (QCL).
  2. Cihazı kontrol etmek için yerleşik yazılımı açın. Yeni bir nanoIR dosyasını açmak için dosyaya ve ardından yeni ye tıklayın. AFM-IR sistemini başlatmak için düğmeye basın.
  3. AFM-IR sistemine alet kapağını açın ve numuneyi temas modunda ölçmek için nominal yarıçapı 30 nm olan silikon altın kaplama prob ve 0,2 N/m yay sabiti monte edin.
  4. Bölüm AFM sondasında Yükle'ye tıklayın ve ardından. Sonda bölümüne odaklanArak kamerayı kantilever'e odaklamak için oklara tıklayın. Kesit örnek XY hareketi,kantilever sonuna çapraz hava yerleştirmek için oklar kullanın.
  5. Algılama lazerinin konumunu kontrol eden düğümleri, lazeri kantilinin sonunda konumlandırmak için döndürün. Dört dörtlük fotodiyot tarafından ölçülen toplamı algılamak ve en üst düzeye çıkarmak için lazer düğümlerini döndürün ve bir değere >3 V. Kavrama sapmasını -1 V'e ayarlamak için sapma düğmesini döndürün ve sonra sonrakinitıklatın. Enstrümanın kapağını kapatın.
  6. Örnek üzerinde bölüm odak kamera örnek odaklanmak için okları kullanın. Daha sonra, kesit örneğinde XY hareketi, numunenin ilgi alanında hareket etmek için okları kullanın ve yaklaşmaya tıklayın ve devreye girin.
  7. Mikroskop penceresinde, numunenin biyofiziksel özelliklerini haritalamak için ilgi kanalları nın girişleri olarak seçin. Özellikle, morfoloji için yükseklik seçin, IR emilimi için Genlik 2 ve pll frekansı harita ipucu örnek temas rezonans.
  8. Denetim penceresinin AFM tarası bölümünde, bölüm 3'teki gibi benzer parametreler kullanın (örneğin, 0.1−1.0 Hz tazyik hızı, 256 x 256 ile 1024 x 1024 piksel arasında). Örnek pürüzlülüğe göre kazançların değerini seçin: integral I = 1−10 ve orantılı P = 10−30. Ardından, bir morfoloji haritası elde etmek için teşle'ye tıklayın.
    NOT: Morfoloji benzer şekilde dinamik dokunma modunda ölçülebilir, ancak AFM-IR ölçümleri burada iletişim modunda gürültü oranlarına daha yüksek sinyal esahip olmak için yapılır.
  9. Morfolojinin haritalaması tamamlandıktan sonra, mikroskop penceresinde, sondayı bir agreganın üstüne konumlandırmak için yükseklik haritasına tıklayın. Daha sonra kontrol penceresinin nanoIR bölümünde, ÖRNEĞI IR lazerle aydınlatmak için start IR'ye tıklayın.
  10. Kızılötesi lazeri kantilever'e odaklamak için optimizasyonatıklayın. Bu pencerede, örneğin yüksek emiciliğe sahip olacak bir dalga numarası yazın ve ekle'yetıklayın. Protein için tipik bir değer 1655 cm-1'dir. IR lazer konumunu bulmak için tarayıp güncellemeye tıklayın ve konumunu kantilever ile hizalamak için güncelleme'ye tıklayın. Pencereyi kapat.
  11. NanoIR ayarı bölümünde, göreli alanda yüksek emicilik beklenen bir dalga numarası yazın. Daha sonra, Bant Geçiş Filtresi seçeneğini devre dışı bırakın ve sayaç okumave cantilever yanıtı hızlı Fourier dönüşümü (FFT) bakmak. FFT penceresinde cantilever rezonans frekansını okumak için yeşil imleci hareket ettirin. Kantilevers rezonans FFT tipik bir değeri yaklaşık 300 kHz olduğunu. Bu rezonans frekans değerini freq. orta alandaki genel bölüme yazın ve 50 kHz'lik bir freq. pencere kullanın.
    NOT: Sayaç okumasını doygunlaştırmayacak, kantilever yanıtında bozulma olmayacak ve numuneyi aşırı ısıtmayacak kadar düşük bir lazer gücü seçin.
  12. Rezonans geliştirilmiş modunu kullanmak için lazer darbe ayar penceresine tıklayın. 300 kHz'lik bir frekans merkezi, 50 kHz'lik bir ayar aralığı ve %5'lik lazer görev döngüsü seçin. Lazerin nabız hızını süpürmek için edinme üzerine tıklayın. Grafikteki imleci kullanarak, lazer darbesini, IR ışığını emen numunenin termal genişlemesinin mekanik tepkisinin frekansına ayarlayın. Ardından, örnek ve ipucu arasındaki temas rezonansını izlemek için PLL seçeneğini belirleyin. PLL penceresindeki sıfır düğmesine basın ve örnek uçlu kontak rezonansını izlemeyi etkinleştirin. Integral kazanç I = 0,5 ve orantılı kazanç P = 10 seçin. Pencereyi kapat.
  13. Optimizasyon penceresini tekrar açın ve numunenin ana emici bantlarına (amide bant I-II-III) karşılık gelen en az 3 dalga numarası ve lazerin her çipi için en az bir dalga numarası için IR lazerin konumunu bulun.
  14. Araçlar 'a tıklayın | IR Arka Plan Kalibrasyonu | Yeni. Pencerede spektroskopik ilgi bölgesini seçin (protein örneklerini incelemek için 1800−1200 cm-1); adım 4.12'de belirlenen aynı nabız oranını ve %5'lik bir görev döngüsünü seçin; hızlı edinimi tıklayın ve lazer hızı seçin, bir kuantum basamaklı lazer için tipik aralığı 20−500 cm-1arasındadır. IR lazer arka planı ölçmek için edinme'ye tıklayın. Bu arka plan spektrumu ölçülen nano ölçekli yerelleştirilmiş spektrumların normalleştirilmesi için kullanılacaktır. Pencereyi kapat.
    NOT: Hızlı lazer ve rezonans gelişmiş modu yoksa, adım 4.12'yi atlayın ve hem arka planda hem de IR spectra edinme pencerelerinde hızlı yerine adımlı spektrumları seçin. Ancak, tek bir toplu duyarlılık ulaşılamayacaktır.
  15. IR spektrum ayarlarında, 1−4 cm-1 ve en az 64x ortak ortalamalar arasında bir IR spektrum çözünürlüğü seçin. Protein aralığında (1800−1200 cm-1)nano ölçekli lokalize IR spektrumu ölçmek için satın almak tıklayın.
  16. Nano ölçekli çözümlenmiş kimyasal harita elde etmek için IR görüntüleme seçeneğini seçin, bir dalga sayısı seçin (örn. amide bandı I için 1655 cm-1) ve AFM taraması penceresindeki taramaya tıklayın.
  17. Eşleme tamamlandıktan sonra dosyaya gidin ve ölçümleri kaydedin. Morfoloji, temas rezonans ve kimyanın edinilmiş haritalarını ve nano ölçekli yerelleştirilmiş spektrumları analiz etmek için yerleşik AFM görüntü işleme yazılımını kullanın. Spectra ve Görüntüler ticari yazılımile daha ayrıntılı analiz için .csv veya .axz dosyaları olarak kaydedilebilir.

5. Kesitsel boyutların görüntü işleme ve analizi

  1. Düzleştirmek ham görüntüler14,17,19,41,42,59 dahili AFM görüntü işleme yazılımı veya ticari yazılım kullanarak.
    NOT: Agregalar, analiz eserlerinden ve ölçülen yüksekliklerinin küçümbirini önlemek için hesaplamadan maskelenmelidir.
  2. Görüntüyü 0 sipariş düzlemine uygun çıkarma ile düzleştirir.
  3. Görüntüyü düzleme düzleştirir ve 1st regresyon sırasına göre satır satır, ikinci adım görüntünün çizgi profilindeki düz taban çizgisine ulaşılıncaya kadar yinelenir.
  4. Örnek çok kalabalıksa, son derece yüksek agregalar içeriyorsa veya tarayıcı yay artefaktı mevcutsa,2.
  5. Fibril eksene dik olarak alınan bir çizgi profilinden toplam yüksekliği ve genişliği ölçün14,17,19,41,42,59.
  6. Fibril uzunluğunu fibril eksenine paralel olarak ölçün14,17,19,41,42,59.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Aβ42 toplamanın temsili bir zaman rotası, ThT floresan tetkik ile ölçüldüğünde, Şekil 1'degösterilmiştir. Toplama işlemi genellikle bir sigmoidal eğri ile karakterizedir, bir gecikme fazı başlangıçta gözlenen nerede, ve dik bir büyüme aşaması tarafından takip, eğri bir plato ulaşmadan önce bir denge sabit devlet ulaşıldığında6,7 , 58. Toplama işlemleri58ile ilgili moleküler ayrıntıları incelemek için yüksek kaliteli veri üretmek için optimize edilmiş bir toplama protokolünün kullanıldığından emin olmak esastır.

AFM'nin yüksek çözünürlüğü, sürecin farklı zaman noktalarında toplanan türlerin morfolojisi ve heterojenliğini araştırmayı sağlar. ThT talimi tarafından izlenen toplama sırasında, plakalardaki numunenin aliquot'ları AFM ve nano-IR(Şekil 1)tarafından tek bir toplu araştırma için hazırlanır. Manuel numune hazırlamanın tipik proses akışı Şekil 2'degösterilmiştir. Numunenin 3Boyutlu morfolojisinin yüksek çözünürlük ve faz kontrollü AFM ile ölçülmesi tamamlandığında, haritalar piezoelektrik tarayıcının doğrusal olmayanlığını ortadan kaldırmak ve numunenin işlem sonrası analizinde hata kaynaklarını azaltmak için düzleştirilir. morfolojisi (Şekil 3). Daha sonra Şekil 4'tegösterildiği gibi doğru ve hassas tek moleküllü istatistiksel analiz yapılabilir. 3B morfoloji haritasından, toplama sırasında bulunan farklı agrega türlerini ayırt etmeye ve karakterize etmeye olanak tanıyan toplu kesit yüksekliği, genişliği ve uzunluğu (veya küresel parçacıklar durumunda çap) ayıklamak mümkündür. ders23,38. Toplama işlemini araştırmak için tipik zaman noktaları gecikme evresi, büyüme evresi ve plato evresidir (Şekil 1). Gecikme evresinde Aβ42'nin monomerik ve oligomerik türleri öncelikle mevcuttur. AFM tarafından görüntülendiğinde, Aβ42'nin monomerik ve oligomerik türleri tipik olarak 1−15 nm çapında ve 0,3−2 nm yüksekliğinde(Şekil 1, sol alt)38,39olarak görünür. Uzamış protofilamentler, protofibriller ve fibrillerin oluşumu Aβ42 toplama süresi nin büyüme aşamasında görülebilir (Şekil 1,alt orta)38,39. Tipik olarak, protofilamentler uzatılmış özellikleri yüzlerce nanometre uzunluğunda ve 0.5−2 nm yüksekliğinde görünürken, protofibriller uzatılmış doğrusal veya kıvrımlı agregalar olarak görünürken 1−5 nm yüksekliğinde ve yüzlerce nanometre uzunluğunda38, 39'a kadar. Plato evresinde fibriller Aβ42 agregalarının baskın türleridir. Aβ42 fibriller genellikle 6−10 nm kesit çapı ve uzunluk sırayla şubesiz, iplik benzeri yapılar olarak görünür eğer mikrometreler (Şekil 3,sağ alt)38,39. Dikkat çekici, agregaların morfolojik özellikleri bu şematik gösterimi en toplayıcı protein ve peptidler genel bir özelliğidir13,14.

Örnek morfolojisinin araştırılmasından sonra nano-IR, hem hava hem de havada nano ölçekli çözülmüş IR haritaları ve spektrumlar elde ederek, toplama işlemi sırasında bulunan bireysel protein agrega türlerinin kimyasal özelliklerini araştırmak için kullanılabilir. yerli sıvı çevre24,26,38,4249,50,51,52,. Şekil 5, AFM-IR kurulumunun şematik bir örneğini göstermektedir. Bir IR kaynağı, örneği şekil 5a'daolduğu gibi alttan veya doğrudan üstten aydınlatmak için kullanılır. Ir ışığı örnek tarafından emilirse, mevcut türlerin ilgili moleküler titreşim enerji geçiş seviyelerini heyecanlandıracaktır. Titreşim enerjisi numunenin içinde termal ısıtma şeklinde dağılır ve bu da numunenin termal genişlemesine neden olur. Bu genleşme nano ölçekte, numuneyle temas halinde ki AFM ucu ile 10 nm sırayla bir çözünürlükle ölçülür. Her darbede, kantilever termal genişlemealgılar. Özellikle, numunenin hızlı genişlemesi, numuneyle temas eden kantilever'i dışarı iter ve tekme den sonra cantilever doğal frekanslarında aşağı halkalar. AFM-IR'nin hassasiyetini artırmak için lazer darbe frekansını54kantilever salınımının aynı frekansında ayarlamak mümkündür. Bu rezonans geliştirilmiş modda çalışabilmek için, genellikle 1−1000 kHz arasında bir aralıkta çalışan kuantum basamaklı lazerler gibi çok çeşitli frekanslarda darbele çalışabilen IR kaynaklarına sahip olmak gerekir. Ham kantilever sapmasının ir genliği olarak adlandırılır, ringdown sinyalinin tepe-to-pik genlik ve hızlı Fourier dönüşümü emilen IR ışık ile orantılıdır. Bu sinyaller, kantilever'in tepesine odaklanmış kırmızı bir lazerin saptırılışını ölçerek gerçek zamanlı olarak tespit edilir. Kimyasal haritalar elde etmek için lazer dalga sayısı belirli bir dalga numarasına sabitlenir ve IR genlik sinyali haritanın her noktasında toplanır, IR spektrumları elde etmek için, kantilin konumu ilgi çekici bir konumda sabitlenir ve lazer dalga boyu ilgi spektroskopik aralığı boyunca süpürülür. AFM-IR'nin nihai çözünürlüğü, Şekil 6'dabelirtildiği gibi, yaklaşık 5 nm kesit yüksekliğine sahip protein agregalarının kimyasal özelliklerinin ölçülmesini sağlar.

Figure 1
Şekil 1: ThT floresan ve AFM ile in vitro toplama süresi dersinin izlenmesi.
ThT floresan tarafından tespit edilen toplama işleminin gecikme evresi, büyüme evresi ve plato evresinde alınan numuneler yüksek çözünürlüklü AFM ile görüntülendi. Bu rakam Ruggeri ve ark.38'denuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: AFM ölçümleri için substrat hazırlama ve numune birikiminin şematik gösterimi.
(A, B) Yapışkan bant kullanarak mika gravür. (C) Örnek ifade. (D) Örnek kuluçka. (E) Ultra saf su ile durulama numunesi. (F) Azot akışı altında numune kurutma. (G) Ucunda keskin ucu olan mikrofabrikasif AFM kantili kullanılarak örnek görüntüleme. (H) Amiloid fibrillerin işlenmiş görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: AFM görüntü işleme prosedürü42.
Her panelin üst kısmında, ilgili AFM görüntüyle gösterilen örnek yüzeyinin profil çizgisi (kırmızı çizgi) görünürken, alt kısımda görüntüdeki tüm piksellerin yüksekliğinin bir histogramı gösterilmektedir. (a) Görüntü düzleme işleminden önce Raw AFM görüntüsü. (b) Tüm düzlem düzleme kullanarak işleme işleminden sonra AFM görüntü. Fibrillar yapılar (pembe renk) düzleştirici işlemden maskelendi. (c) Görüntü satır satır düzleme yordamı kullanılarak işlenir. (d) Görüntü işleme işleminden sonraki son görüntü. Bu rakam Ruggeri ve ark.42'denuyarlanmıştır.

Figure 4
Şekil 4: AFM görüntülerinin tek toplu istatistiksel analizi.
(a) 1 ve 2 ile gösterilen fibriller yapıların yükseklik ve uzunluklarının izlenmesiörneği. (b) İzlenmiş fibrillerin bölümleri ve ortalama yüksekliği ile grafik. (c) Fibriller yapıların ortalama yüksekliğini gösteren histogram örneği. (d) İzli fibriller1 ve 2'nin normalleştirilmiş profiline sahip grafik. (e) Normalleştirilmiş profil yükseklik noktalarının histogram dağılımı. Bu rakam Ruggeri ve ark.42'denuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: AFM-IR yönteminin çalışma prensibi.
(a) Emilen IR ışığı numunenin termal genişlemesine neden olur ve numuneyle temas eden AFM kantilinin mekanik rezonanslarını heyecan verici bir şekilde heyecan vericidir. Kantilever salınımlarının genliği IR emilimi ile orantılıdır. (b) IR emme haritaları, lazer dalga boyu sabitlenirken numune üzerindeki kantilever'i tarayarken elde edilir. (c) Temastaki uç ve numune, rezonans sıklığı numunenin içsel sertliği ile monotonolarak artan birleştirilmiş yaylar sistemi olarak50. (d)AFM kantilinin konumu sabitlenirken lazer dalga boyu süpürülerek lokalize spektrum elde edilir. (e) ProteinIR spektrumu. (f) Özetle, AFM-IR nanoölçekli26morfolojik, mekanik ve kimyasal özellikleri eşzamanlı çalışma sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Tek bir amiloid agregasının kızılötesi nanospektroskopisi (nano-IR).
(a) AFM morfoloji haritası. (b) 1658 cm-1'delazer rezonans zirvesinde IR emilim haritası . (c) Fibril yüksekliğinin kesitsel boyutları. (d) Fibriller yapının farklı konumlarında (mavi dairelerle b panelinde işaretli) ve substrat (yeşil dairelerle b panelinde işaretlenmiş) ir spektrumları. Toplam yapıdan (düz siyah çizgi) elde edilen ortalama net sinyal, ortalama fibral sinyalinden (düz mavi çizgi) ortalama arka plan sinyali (düz yeşil çizgi) çıkarılarak elde edilmiştir. Bu rakam Ruggeri ve ark.42'denuyarlanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokoldeki ilk kritik adım, 1.1 ve 1.2 adımlarında tanımlanan Aβ42 çözeltisi gibi monomerik proteinlerin hazırlanmasıdır. Oligomerik veya birleştirilmiş türlerin varlığı, toplama kinetiğinin yetersiz tekrarlanabilirliğine neden olabileceğinden ve AFM'deki eserleri ikna edebileceğinden, sonderece saf, monomerik bir çözeltiden toplama işlemini başlatmak esastır. ölçümler (örn. fibriller türler agregasyonun ilk aşamalarında belirgin olacaktır), bu da verilerin yanlış yorumlanmasına yol açabilir. ThT floresan sataşma dayalı amiloid oluşumunun son derece tekrarlanabilir kinetik verileri, kimyasal kinetik ana denklem formalizm ile birlikte5,6,7, Aβ42 toplama tanımlamak için izin altta yatan moleküler olaylar açısından mekanizma. Kimyasal kinetik, amiloid oluşumunun altında yatan mikroskobik adımları, örneğin agrega uçlarında veya sekonder uzaması gibi yeni agregaların oluşup büyüyebileceği farklı yolları göz önünde bulundurarak makroskopik bulgularıyla birbirine bağlar. toplam yüzeyinde çekirdekleşme. Ancak, kimyasal kinetik tek molekül lütfetmeli yöntemlerle birleşerek nano ölçekte olası nükleasyon fenomenlerinin görselleştirilmesini doğrudan sağlamaz.

Bu protokolün ikinci kritik adımı, 2.2 ve 2.6−2.8 adımlarında tanımlanan substrat hazırlama ve örnek biriktirme prosedürleridir. Eserlerden kaçınmak için, numune temiz, atomik olarak düz bir yüzeye yatırılmalıdır. AFM ölçümlerinde eser içermeyen, yüksek çözünürlüklü mikanın düzgün şekilde gravürlenmesi esastır. Daha uzun kuluçka süresi substrat yüzeyinde daha iyi emilimi sağladığından, numune biriktirme süresi de son derece önemlidir. Ancak, aynı zamanda yapay öz-organizasyon ve kendi kendine montaj neden olabilir25, hangi veri yanlış yorumlanmasına yol açabilir eserler (örneğin, yüzey kaynaklı toplam türler) neden olabilir. Buna ek olarak, mika yüzeyi negatif yüklüdür, bu da sadece pozitif yüklü moleküllerin kolayca emdiği anlamına gelir. Örneğin net yükü negatifse, mikanın yüzeyi daha iyi bir phisisorpsiyon için APTES kullanılarak pozitif olarak işlevselhale getirilebilir23. Mikroakışkan sprey birikimi25 bu etkileri ve eserleri önlemek ve tek bir adım ve eser ücretsiz bir şekilde örnek mevduat yararlanmak olabilir.

Üçüncü kritik adım, bölüm 3'te açıklanan AFM ve AFM-IR ile örnek görüntüleme için uygun kurulum ve görüntüleme parametrelerinin seçimidir. Örnek görüntüleme için kullanılan AFM ipuçları, yüksek çözünürlük teveksyonu elde etmek ve kıvrım etkilerini en aza indirmek için yeterince keskin olmalıdır (2−8 nm apeks yarıçapı) (örnek özelliklerinin uçtarafından genişletilmesi)14, bu da numunenin görüntüsünde belirsizliklere neden olabilir. Görüntüleme modu, temas veya dinamik seçimi de önemlidir. Konvansiyonel AFM ile numune görüntülemeiçin, ikinci mod numune hasarına neden olabilecek ve ölçümlerde (örn. nanoindentasyon nedeniyle örnek yüksekliği)14,61,62. Tersine, afm-IR sinyalini geliştirmek için nano-IR üzerinden ölçümler için temas modu tercih edilir. Dinamik modda ölçümler için, kantilsadece biraz altında ayarlanmalıdır (dokunma modu) veya üstü (temassız modu) ölçümleri daha yüksek istikrar sağlamak için salınım ilk ücretsiz rezonans maksimum14. Piksel sayısına ve taramaya bağlı olarak görüntüleme çözünürlüğü, bir numunede bulunan en küçük ayrıntı derecesini (örn. 4 x 4 μm2 alan için 1024 x 1024 piksel)14,63'ü yakalayacak kadar yüksek olmalıdır. Düşük görüntüleme çözünürlüğü, sinyalin sayısallaştırılması üzerine dikey ve yanal bilgi kaybı nedeniyle numunenin görüntüsünde bozulmalara ve belirsizliklere neden olabilir14. Görüntüleme için kullanılan tbmm hızı, uç yüzey özelliklerini düzgün bir şekilde takip edebilmek ve kimyasal bilgi elde etmek için yeterli zamana sahip olmak için yeterince düşük olmalıdır14. En önemli görüntüleme parametrelerinden biri görüntüleme kuvvetidir. Temas modunda, numunenin yapısını korumak için düşük etkileşim kuvveti kullanmak esastır. Dinamik modda, farklı örneklerin morfolojisini tutarlı bir şekilde karşılaştırmak için numuneler üzerindeki enerji dağılımı sabit tutulmalıdır; δ20°14,42'yigeçmeyen bir faz değişiminin sabit bir rejimi korunarak bağımsız numunelerin tutarlı bir şekilde görüntülenmesi elde edilebilir. Örnek görüntülerde bozulmalara ve belirsizliklere neden olabilecekleri için büyük görüntüleme kuvvetlerinden kaçınılmalıdır.

Termal dalgalanmalar nedeniyle AFM parçalarının genişlemesi ve daralması nedeniyle oluşan termal sürüklenme, örnek64,65'in görüntüsünde deformasyonlara ve eşyalara neden olabilir. Dikey yöndeki sürüklenmeler, kantilin yüzeyizin izini kaybetmesine ve yüzeye çarpmasına neden olabilir, yanal yöndeki sürüklenmeler ise genellikle yüzey özelliklerinin uzaması ve görüntü bozulmasına neden olur, bu da örnek özelliklerinin kesin ölçümlerini elde etmek. Bu termal sürüklenmelerin etkisi laboratuvarın doğru sıcaklık kontrolü ile en aza indirilebilir ve sistemin stabil olması için yeterli zaman (yaklaşık 30 dk) vererek veya hızlı taramalar yaparak66,67,68 , 69.000 , 70'e kadar.

AFM-IR tarafından nano-IR görüntüleme ve spektrum toplama kalitesi çeşitli faktörlerden etkilenebilir, bunlardan en önemlisi şunlardır: (i) IR arka plan tarafından örnek üzerinde IR sinyalinin yanlış bir bölümü, (ii) ucu arasında nanomekanik temas büyük bir varyasyon ve örnek ve (iii) yumuşama neden örnek aşırı ısıtma. Numunenin IR spektrumunun toplanan arka plana doğru bir şekilde bölünmesi için, aynı lazer gücüyle toplanmaları çok önemlidir. Gerçekten de, IR lazer arka plan spektral çizgi şekli lazer gücüne bağlıdır. Daha sonra, numunenin mekanik özelliklerinin ölçülen kimyasal bilgilere etkisini önlemek için, spektrum ve görüntü edinimi sırasında numune ile uç arasındaki temas rezonansını izlemek ve izlemek çok önemlidir. Spektrum alımı için, ideal olarak, sabit bir temas rezonans lazer darbe için yeterlidir. Ancak, spektrum büyük bir spektroskopik aralıkta elde edilirse, yüksek yoğunluklu zirveler numunenin güçlü Bir Şekilde ısıtılmasına ve yumuşatılmasına neden olabilir, böylece uç numunekontak rezonansını değiştirebilir ve yapay olarak IR pik genliğini azaltabilir. Bu nedenle spektrumun numunenin aşırı ısınmadan etkilenmediğini doğrulamak için spektrum alımı sırasında kontak rezonansının izlenmesi önemlidir.

Sonuç olarak, konvansiyonel AFM ve nano-IR yüksek çözünürlüklü protein toplama24,38sırasında oluşan bireysel türlerin morfolojik, yapısal ve kimyasal özellikleri araştırma yeteneğine sahiptir. Ancak, yerel toplu koşullarda oluşumuonların hızlı kinetik takip etmek kimyasal kinetik yeteneği yoksundur. Proteinin toplama ve yanlış katlama sırasında geçirdiği konformasyonel değişiklikleri çözmek için, toplu biyofiziksel metotların yeteneklerini bir araya getirebilen yeni biyofiziksel yöntemler geliştirmek ve uygulamak gerekir. nano ölçekte protein agregasyonunun heterojenliği ve ultrayapısal özelliklerinin araştırılması. Bu yaklaşım, protein kendi kendine montaj sorunu ve sağlık ve hastalık rolünü anlamak sorunu ele almak için verimli bir yol temsil eder. Gerçekten de, tek bira yaklaşımlar çözülme ve protein toplama polimorfizm ve oluşumumoleküler mekanizmaları açıklığa kavuşturmak yeteneğine sahiptir. Bu bilgiler, protein agregasyonunun anlaşılması ve insan hastalıklarının başlangıcı ve ilerlemesindeki rolünün yanı sıra biyoteknoloji uygulamaları için biyofiziksel özelliklerini anlama nın zorluklarını ele almak için merkezi bir konudur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Yazarlar İsviçre Ulusal Bilim Vakfı'na (SNF) mali destek için teşekkür (hibe numarası P2ELP2_162116 ve P300P2_171219), Darwin College, Erasmus+ programı için mali destek için (hibe numarası 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) ve bu sonuçlara yol açan araştırmalar, Avrupa Birliği'nin Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi'nden ERC hibe PhysProt (anlaşma numarası 337969), Newman Vakfı (T.P.J.K.) ve Cambridge Misfolding Hastalıkları Merkezi (C.G., M.V., ve T.P.J.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM-IR system Anasys Instruments nanoIR 2 or 3 Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape Corning 6570
Double Sided Adhesive Discs AGAR Scientific AGG3347N
FLUOstar Omega BMG Labtech 415-101 Platereader
Mica Disc 10mm V1 AGAR Scientific AGF7013
Park NX10 AFM system Park Systems N/A Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips Platypus Technologies AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers Park Systems PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL Eppendorf 30108132
Silicon gold coated cantilevers Anasys Instruments PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm AGAR Scientific AGF7001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
  2. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 1-21 (2017).
  3. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: A summary of progress over the last decade. Annual Review of Biochemistry. 86, 27-68 (2017).
  5. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 384-396 (2014).
  6. Meisl, G., et al. Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models. Nature Protocols. 11, 252-272 (2016).
  7. Knowles, T. P. J., et al. An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly. Science. 326, 1533-1537 (2009).
  8. Barth, A. Infrared spectroscopy of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1767, 1073-1101 (2007).
  9. Fitzpatrick, A. W. P., et al. Atomic structure and hierarchical assembly of a cross- amyloid fibril. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5468-5473 (2013).
  10. Cohen, S. I. A., et al. Proliferation of amyloid-β42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9758-9763 (2013).
  11. Michaels, T. C. T., Lazell, H. W., Arosio, P., Knowles, T. P. J. Dynamics of protein aggregation and oligomer formation governed by secondary nucleation. Journal of Chemical Physics. 143, (2015).
  12. Šarić, A., Michaels, T. C. T., Zaccone, A., Knowles, T. P. J., Frenkel, D. Kinetics of spontaneous filament nucleation via oligomers: Insights from theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 145, 211926 (2016).
  13. Ruggeri, F. S., Habchi, J., Cerreta, A., Dietler, G. AFM-based single molecule techniques: Unraveling the amyloid pathogenic species. Current Pharmaceutical Design. 22, 3950-3970 (2016).
  14. Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Atomic force microscopy for single molecule characterisation of protein aggregation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 664, 134-138 (2019).
  15. Iljina, M., et al. Nanobodies raised against monomeric α-synuclein inhibit fibril formation and destabilize toxic oligomeric species. BMC Biology. 15, 1-14 (2017).
  16. Schilling, C., et al. Sequence-Optimized Peptide Nanofibers as Growth Stimulators for Regeneration of Peripheral Neurons. Advanced Functional Materials. 1809112, 1-15 (2019).
  17. Chiki, A., et al. Mutant exon1 huntingtin aggregation is regulated by T3 phosphorylation-induced structural changes and crosstalk between T3 phosphorylation and acetylation at K6. Angewandte Chemie - International Edition. 56, 5202-5207 (2017).
  18. Sieste, S., et al. Water-dispersible polydopamine-coated nanofibers for stimulation of neuronal growth and adhesion. Advanced Healthcare Materials. 7, 1-11 (2018).
  19. De, S., et al. Different soluble aggregates of Aβ42 can give rise to cellular toxicity through different mechanisms. Nature Communications. 10, 1541 (2019).
  20. Chang, K. C., Chiang, Y. W., Yang, C. H., Liou, J. W. Atomic force microscopy in biology and biomedicine. Tzu Chi Medical Journal. 24, 162-169 (2012).
  21. Variola, F. Atomic force microscopy in biomaterials surface science. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 2950-2959 (2015).
  22. Drolle, E., Hane, F., Lee, B., Leonenko, Z. Atomic force microscopy to study molecular mechanisms of amyloid fibril formation and toxicity in Alzheimer’s disease. Drug Metabolism Reviews. 46, 207-223 (2014).
  23. Ruggeri, F. S., et al. Identification and nanomechanical characterization of the fundamental single-strand protofilaments of amyloid α-synuclein fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7230-7235 (2018).
  24. Ruggeri, F. S., et al. Infrared nanospectroscopy characterization of oligomeric and fibrillar aggregates during amyloid formation. Nature Communications. 6, 1-9 (2015).
  25. Ruggeri, F. S., et al. Microfluidic deposition for resolving single-molecule protein architecture and heterogeneity. Nature Communications. 9, (2018).
  26. Qamar, S., et al. FUS phase peparation is modulated by a molecular chaperone and methylation of arginine cation-π interactions. Cell. 173, 720-734 (2018).
  27. Habchi, J., et al. Cholesterol catalyses Aβ42 aggregation through a heterogeneous nucleation pathway in the presence of lipid membranes. Nature Chemistry. 10, 673-683 (2018).
  28. Sweers, K. K. M., Stöckl, M., Bennink, M. L., Subramaniam, V. Characterizing nanoscale morphologic and mechanical properties of α-Synuclein amyloid fibrils with atomic force microscopy. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding & Aggregation. Uversky, V. N., Lyubchenko, Y. L. , London, UK. 309-322 (2014).
  29. Goldsbury, C., et al. Amyloid structure and assembly Insights from scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 173, 1-13 (2011).
  30. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Devlin, G. L., Dobson, C. M., Welland, M. E. Analysis of structural order in amyloid fibrils. Nanotechnology. 18, (2007).
  31. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. , 6546-6561 (2016).
  32. Knowles, T. P. J., Oppenheim, T. W., Buell, A. K., Chirgadze, D. Y., Welland, M. E. Nanostructured films from hierarchical self-assembly of amyloidogenic proteins. Nature Nanotechnology. 5, 204-207 (2010).
  33. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Craig, A., Dobson, C. M., Welland, M. E. Spatial persistence of angular correlations in amyloid fibrils. Physical Review Letters. 96, 1-4 (2006).
  34. Knowles, T. P. J., et al. Twisting transition between crystalline and fibrillar phases of aggregated peptides. Physical Review Letters. 109, 158101 (2012).
  35. Knowles, T. P., et al. Role of intermolecular forces in defining material properties of protein nanofibrils. Science. 318, 1900-1903 (2007).
  36. Smith, J. F., Knowles, T. P. J., Dobson, C. M., MacPhee, C. E., Welland, M. E. Characterization of the nanoscale properties of individual amyloid fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 15806-15811 (2006).
  37. Sokolov, D. V. Atomic force microscopy for protein nanotechnology. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 300, 323-367 (2013).
  38. Ruggeri, F. S., et al. Influence of the β-sheet content on the mechanical properties of aggregates during amyloid fibrillization. Angewandte Chemie - International Edition. 54, 2462-2466 (2015).
  39. Jeong, J. S., Ansaloni, A., Mezzenga, R., Lashuel, H. A., Dietler, G. Novel mechanistic insight into the molecular basis of amyloid polymorphism and secondary nucleation during amyloid formation. Journal of Molecular Biology. 425, 1765-1781 (2013).
  40. Adamcik, J., Mezzenga, R. Study of amyloid fibrils via atomic force microscopy. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 17, 369-376 (2012).
  41. Deguire, S. M., et al. N-terminal huntingtin (Htt) phosphorylation is a molecular switch regulating Htt aggregation, helical conformation, internalization, and nuclear targeting. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
  42. Ruggeri, F. S., et al. Nanoscale studies link amyloid maturity with polyglutamine diseases onset. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  43. Adamcik, J., et al. Understanding amyloid aggregation by statistical analysis of atomic force microscopy images. Nature Nanotechnology. 5, 423-428 (2010).
  44. Lin, Y. C., Komatsu, H., Ma, J., Axelsen, P. H., Fakhraai, Z. Quantitative analysis of amyloid polymorphism using height histograms to correct for tip convolution effects in atomic force microscopy imaging. RSC Advances. 6, 114286-114295 (2016).
  45. Mannini, B., et al. Stabilization and characterization of cytotoxic Aβ40 oligomers isolated from an aggregation reaction in the presence of zinc ions. ACS Chemical Neuroscience. , (2018).
  46. Medalsy, I., Hensen, U., Muller, D. J. Imaging and quantifying chemical and physical properties of native proteins at molecular resolution by force-volume AFM. Angewandte Chemie - International Edition. 50, 12103-12108 (2011).
  47. Dufrêne, Y. F., Martínez-Martín, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Müller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve–based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
  48. Takai, E., et al. Scanning electron microscope imaging of amyloid fibrils. American Journal of Biochemistry and Biotechnology. 10, 31-39 (2014).
  49. Dazzi, A., et al. AFM-IR: Combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Applied Spectroscopy. 66, 1365-1384 (2012).
  50. Volpatti, L. R., et al. Micro- and nanoscale hierarchical structure of core-shell protein microgels. Journal of Materials Chemistry B. 4, 7989-7999 (2016).
  51. Galante, D., et al. A critical concentration of N-terminal pyroglutamylated amyloid beta drives the misfolding of Ab1-42 into more toxic aggregates. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 79, 261-270 (2016).
  52. Ruggeri, F. S., et al. Identification of oxidative stress in red blood cells with nanoscale chemical resolution by infrared nanospectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 19, 1-14 (2018).
  53. Ramer, G., Ruggeri, F. S., Levin, A., Knowles, T. P. J., Centrone, A. Determination of polypeptide conformation with nanoscale resolution in water. ACS Nano. 12 (7), 6612-6619 (2018).
  54. Dazzi, A., Prater, C. B. AFM-IR: Technology and applications in nanoscale infrared spectroscopy and chemical imaging. Chemical Reviews. 117, 5146-5173 (2017).
  55. Lahiri, B., Holland, G., Centrone, A. Chemical imaging beyond the diffraction limit: experimental validation of the PTIR technique. Small. 9 (3), 439-445 (2013).
  56. Ansaloni, A., et al. One-pot semisynthesis of exon 1 of the huntingtin protein: New tools for elucidating the role of posttranslational modifications in the pathogenesis of Huntington’s disease. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (7), 1928-1933 (2014).
  57. Khalaf, O., et al. The H50Q mutation enhances α-synuclein aggregation, secretion, and toxicity. Journal of Biological Chemistry. 289, 21856-21876 (2014).
  58. Hellstrand, E., Boland, B., Walsh, D. M., Linse, S. Amyloid β-protein aggregation produces highly reproducible kinetic data and occurs by a two-phase process. ACS Chemical Neuroscience. 1, 13-18 (2010).
  59. Limbocker, R., et al. Trodusquemine enhances Aβ42 aggregation but suppresses its toxicity by displacing oligomers from cell membranes. Nature Communications. 10 (1), 225 (2019).
  60. Lu, F., Belkin, M. A. Infrared absorption nano-spectroscopy using sample photoexpansion induced by tunable quantum cascade lasers. Optics Express. 19, 1902-1904 (2011).
  61. Jiao, Y., Schäffer, T. E. Accurate height and volume measurements on soft samples with the atomic force microscope. Langmuir. 20, 10038-10045 (2004).
  62. Müller, D. J., Engel, A. The height of biomolecules measured with the atomic force microscope depends on electrostatic interactions. Biophysical Journal. 73, 1633-1644 (1997).
  63. Heymann, J. B., Moller, C., Muller, D. J. Sampling effects influence heights measured with atomic force microscopy. Journal Of Microscopy-Oxford. 207, 43-51 (2002).
  64. Marinello, F., Balcon, M., Schiavuta, P., Carmignato, S., Savio, E. Thermal drift study on different commercial scanning probe microscopes during the initial warming-up phase. Measurement Science and Technology. 22, 9 (2011).
  65. Marinello, F., Bariani, P., De Chiffre, L., Savio, E. Fast technique for AFM vertical drift compensation. Measurement Science and Technology. 18, 689-696 (2007).
  66. Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in AFM imaging (Clifton, N.J.). Methods in Molecular Biology. 242, 25-27 (2004).
  67. Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research. Braga, P. C., Ricci, D. 736, Humana Press. New York, NY. 31-43 (2011).
  68. Marinello, F., Carmignato, S., Voltan, A., Savio, E., De Chiffre, L. Error Sources in Atomic Force Microscopy for Dimensional Measurements: Taxonomy and Modeling. Journal of Manufacturing Science and Engineering. 132, 030903 (2010).
  69. Ukraintsev, E., Kromka, A., Kozak, H., Reme, Z., Rezek, B. Artifacts in Atomic Force Microscopy of Biological Samples. Atomic Force Microscopy Investigations into Biology - From Cell to Protein. Frewin, C. L. , (2012).
  70. Tsukruk, V. V., Singamaneni, S. Scanning Probe Microscopy of Soft Matter: Fundamentals and Practices. , Wiley-VCH Verlag GmbH. Weinheim, Germany. (2011).

Tags

Biyokimya Sayı 151 amiloid nörodejenerasyon protein agregasyonu atomik kuvvet mikroskopisi kızılötesi nanospektroskopi tek molekül analizi spektroskopi
Bireysel Protein Agregalarının Kızılötesi Nanospektroskopi ve Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Karakterizeleştirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ruggeri, F. S., Šneideris, T.,… More

Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Chia, S., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60108, doi:10.3791/60108 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter