Оптимизированная реакция Griess для UV-Vis и Голый глаз Определение противомалярийных Primaquine
Summary
Этот протокол описывает новый колористетрический метод для обнаружения противомалярийных примахин (ПМЗ) в синтетических мочах и сыворотках человека.
Abstract
Primaquine (ПМЗ), важный противомалярийный препарат, был рекомендован Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) для лечения опасных для жизни инфекций, вызванных P. vivax и ovale. Тем не менее, ПМЗ имеет нежелательные побочные эффекты, которые приводят к острому гемолизу у пациентов с дефицитом глюкозы-6-фосфат дегидрогеназы (G6PD). Существует необходимость в разработке простых и надежных методов определения ПМЗ с целью мониторинга дозировки. В начале 2019 года мы сообщили о УФ-Вис и невооруженным глазом подход для PM’ колористельной количественной оценки. Обнаружение было основано на Griess-подобной реакции между ПМЗ и анилинами, которые могут генерировать цветные продукты азо. Предел обнаружения для прямого измерения ПМЗ в синтетической моче находится в наномолярном диапазоне. Кроме того, этот метод показал большой потенциал для количественной оценки ПМЗ из образцов сыворотки человека в клинически значимых концентрациях. В этом протоколе мы опишите технические детали, касающиеся синтеза и характеристики цветных продуктов азо, подготовки реагента, а также процедур определения ПМЗ.
Introduction
ПМЗ является одним из наиболее важных противомалярийных препаратов, он работает не только как шизонтоцид тканей для предотвращения рецидива, но и как геймтоцитоцид, чтобы прервать передачу болезни1,2,3,4. Внутрисосудистый гемолизявляется является одним из связанных побочных эффектов ПМЗ, который становится чрезвычайно серьезным в тех, дефицит G6PD. Известно, что генетическое заболевание G6PD распространяется по всему миру с частотой генов между 3-30% в эндемичных по малярии районах. Тяжесть слабости ПМЗ зависит от степени дефицита G6PD, а также дозы и продолжительности воздействия ПМЗ5,6. Для снижения риска ВОЗ рекомендовала для лечения малярии одну низкую дозу (0,25 мг базы/кг) ПМЗ. Тем не менее, это по-прежнему оспаривается изменения в чувствительности пациента наркотиков5,7. Мониторинг дозы необходим для оценки фармакокинетики после введения ПМЗ, что может повлиять на корректировку дозировки для успешного лечения с ограниченной токсичностью.
Высокопроизводительная жидкая хроматография (HPLC) является наиболее широко используемым методом клинического определения ПМЗ. Эндох и др. сообщили о системе HPLC с УФ-детектором для количественной оценки сыворотки с помощью колонки полимерного геля C-188. В их системе белки сыворотки сначала осаждались ацетонитрилом, а затем ПМЗ в супернатанте был отделен для HPLC. Кривая калибровки была линейной над диапазоном концентрации от 0,01-1,0 мкг/мл8. Другой метод, основанный на обратной фазе HPLC с УФ-обнаружением на уровне 254 нм, был зарегистрирован для количественной оценки ПМЗ и его основных метаболитов9. Кривая калибровки для ПМЗ была линейной в диапазоне от 0,025-100 мкг/мл. Дополнительная жидко-жидкая экстракция со смешанным гексаном и этиловым ацетатом в качестве органической фазы использовалась для разделения ПМЗ с процентным восстановлением, достигаемым до 89%9. Совсем недавно, Миранда и др. разработали метод UPLC с УФ-обнаружения на 260 нм для анализа ПМЗ в таблетках формулировки с пределом обнаружения на 3 мкг /мл10.
Хотя методы HPLC демонстрируют многообещающую чувствительность в определении наркотиков и чувствительность может быть дополнительно улучшена, если HPLC оснащен масс-спектрометр, Есть еще некоторые недостатки. Прямые измерения лекарственных средств в биологических жидкостях, как правило, недоступны HPLC, так как многие биомолекулы могут значительно влиять на анализ. Дополнительные экстракции необходимы для удаления эндогенных молекул до анализа HPLC11,12. Кроме того, обнаружение ПМЗ с помощью детектора HPLC-UV обычно выполняется на максимальной длине волны поглощения (260 нм); однако в биологических жидкостях много эндогенных молекул с сильным абсорбцией на уровне 260 нм (например, аминокислоты, витамины, нуклеиновые кислоты и урохромные пигменты), что мешает обнаружению УФ-излучения ПМЗ. Необходимо разработать простые и экономически эффективные методы определения ПМЗ с разумной чувствительностью и избирательностью.
Реакция Griess впервые была представлена в 1879 году в качестве колориметрического теста для обнаружения нитритов13,14,15,16. В последнее время эта реакция была широко изучена для обнаружения не только нитрита, но и других биологически значимых молекул17,18,19,20. Ранее мы сообщали о первом систематическом исследовании неожиданной реакции Грисса с ПМЗ(рисунок 1). В этой системе, ПМЗ способен образовывать цветные азо, когда в сочетании с заменой анилин в присутствии нитритов ионов в кислых условиях. Мы также обнаружили, что цвет азов варьировался от желтого до синего при увеличении эффекта пожертвований электрона на анилин21. Уф-виз поглощения на основе колористического метода для количественной оценки ПМЗ был разработан с помощью оптимизированной реакции между 4-метоксианилин и ПМЗ. Этот метод показал большой потенциал для чувствительного и селективного обнаружения ПМЗ в биосоответствующих жидкостях. Здесь мы стремимся описать подробные процедуры определения ПМЗ, основанные на этой колористельной стратегии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описали колористетрический метод для удобной количественной оценки ПМЗ. Потенциально это самый простой и экономически эффективный текущий метод. Что еще более важно, этот метод предлагает позволяет невооруженным глазом измерения PM, без использования какого-либо оборудования.
<p c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают, что Грант стартапа от Университета китайской медицины Гуанчжоу и молодежный проект подготовки научных исследований ГЗУКМ (2019 г.н.). Мы также признаем Лингнан медицинский исследовательский центр Гуанчжоу Университета китайской медицины за поддержку на объектах.
Materials
| 4-Methoxyaniline | Aladdin | K1709027 | |
| 2,4-Dimethoxyaniline | Heowns | 10154207 | |
| 3,4-Dimethoxyaniline | Bidepharm | BD21914 | |
| 4-Methylaniline | Adamas-beta | P1414526 | |
| 4-Nitroaniline | Macklin | C10191447 | |
| 96-wells,Flat Botton | Labserv | 310109008 | |
| Gaussian@16 software | Gaussian, Inc | Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux | |
| Hydrochloric acid | GCRF | 20180902 | |
| Marvin sketch (software) | CHEMAXON | free edition: 15.6.29 | |
| Phosphoric acid | Macklin | C10112815 | |
| Primaquine bisiphosphate | 3A Chemicals | CEBK200054 | |
| Sodium nitrite | Alfa Aesar | 5006K18R | |
| Sulfonamides | TCI(shanghai) | GCPLO-BP | |
| Varioskan LUX Plate reader | Thermo Fisher | Supplied with SkanIt Software 4.1 |
References
- Fernando, D., Rodrigo, C., Rajapakse, S. Primaquine in vivax malaria: an update and review on management issues. Malar Journal. 10, 351 (2011).
- Deng, C., et al. Large-scale Artemisinin-Piperaquine Mass Drug Administration With or Without Primaquine Dramatically Reduces Malaria in a Highly Endemic Region of Africa. Clinical Infectious Diseases. 67 (11), 1670-1676 (2018).
- Pavic, K., et al. Primaquine hybrids as promising antimycobacterial and antimalarial agents. European Journal of Medical Chemistry. 143, 769-779 (2018).
- McQueen, A., et al. Synthesis, characterization, and cellular localization of a fluorescent probe of the antimalarial 8-aminoquinoline primaquine. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27 (20), 4597-4600 (2017).
- Ashley, E. A., Recht, J., White, N. J. Primaquine: the risks and the benefits. Malaria Journal. 13 (1), 418 (2014).
- Watson, J., Taylor, W. R., Menard, D., Kheng, S., White, N. J. Modelling primaquine-induced haemolysis in G6PD deficiency. Elife. 6, (2017).
- Beutler, E. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency: a historical perspective. Blood. 111 (1), 16-24 (2008).
- Endoh, Y. S., et al. High-performance liquid chromatographic determination of pamaquine, primaquine and carboxy primaquine in calf plasma using electrochemical detection. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 579 (1), 123-129 (1992).
- Dua, V. K., Kar, P. K., Sarin, R., Sharma, V. P. High-performance liquid chromatographic determination of primaquine and carboxyprimaquine concentrations in plasma and blood cells in Plasmodium vivax malaria cases following chronic dosage with primaquine. Journal of Chromatography B: Biomedical Applications. 675 (1), 93-98 (1996).
- Miranda, T. A., Silva, P. H. R., Pianetti, G. A., César, I. C. Simultaneous quantitation of chloroquine and primaquine by UPLC-DAD and comparison with a HPLC-DAD method. Malaria Journal. 14, 29 (2015).
- Tatsuno, M., Nishikawa, M., Katagi, M., Tsuchihashi, H. Simultaneous determination of illicit drugs in human urine by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Analytical Toxicology. 20 (5), 281-286 (1996).
- Erni, F. Use of high-performance liquid chromatography in the pharmaceutical industry. Journal of Chromatography A. 507, 141-149 (1990).
- Tsikas, D. Analysis of nitrite and nitrate in biological fluids by assays based on the Griess reaction: Appraisal of the Griess reaction in the l-arginine/nitric oxide area of research. Journal of Chromatography B. 851 (1), 51-70 (2007).
- Zurcher, D. M., Adhia, Y. J., Romero, J. D., McNeil, A. J. Modifying a known gelator scaffold for nitrite detection. Chemical Communications. 50 (58), 7813-7816 (2014).
- Kunduru, K. R., Basu, A., Tsah, T., Domb, A. J. Polymer with pendant diazo-coupling functionality for colorimetric detection of nitrates. Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 21-26 (2017).
- Li, D., Ma, Y., Duan, H., Deng, W., Li, D. Griess reaction-based paper strip for colorimetric/fluorescent/SERS triple sensing of nitrite. Biosensors and Bioelectronics. 99, 389-398 (2018).
- Deng, T., et al. A novel strategy for colorimetric detection of hydroxyl radicals based on a modified Griess test. Talanta. 195, 152-157 (2019).
- Pang, H., et al. A photo-responsive macroscopic switch constructed using a chiral azo-calix[4]arene functionalized silicon surface. Chemical Communications (Camb). 54 (24), 2978-2981 (2018).
- Kaur, N., Dhaka, G., Singh, J. Simple naked-eye ratiometric and colorimetric receptor for anions based on azo dye featuring with benzimidazole unit. Tetrahedron Letters. 56 (9), 1162-1165 (2015).
- Liu, F., Lou, J., Hristov, D. X-Ray responsive nanoparticles with triggered release of nitrite, a precursor of reactive nitrogen species, for enhanced cancer radiosensitization. Nanoscale. 9 (38), 14627-14634 (2017).
- Deng, T., et al. An unexpected Griess reaction on the important anti-malarial drug primaquine and its application for drug determination. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 171, 8-14 (2019).
- Shrivastava, A., Gupta, V. Methods for the determination of limit of detection and limit of quantitation of the analytical methods. Chronicles of Young Scientists. 2 (1), 21-25 (2011).
