Reazione Griess ottimizzata per UV-Vis e determinazione a occhio nudo di Primaquine antimalarico
Summary
Questo protocollo descrive un nuovo metodo colorimetrico per il rilevamento dei primachi antimalarici (PMQ) nelle urine sintetiche e nei sieri umani.
Abstract
Primachina (PMQ), un importante farmaco antimalarico, è stato raccomandato dall’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) per il trattamento delle infezioni potenzialmente letali causate da P. vivax e ovale. Tuttavia, PMQ ha effetti avversi indesiderati che portano a emolisi acuta in pazienti con carenza di dehydrogenasi glucosio-6 fosfato (G6PD). C’è la necessità di sviluppare metodi semplici e affidabili per la determinazione PMQ con lo scopo di monitoraggio del dosaggio. All’inizio del 2019, abbiamo segnalato un approccio UV-Vis e basato ad occhio nudo per la quantificazione colorimetrica PMQ. Il rilevamento si è basato su una reazione simile a Griess tra PMQ e aniline, che può generare prodotti azo colorati. Il limite di rilevazione per la misurazione diretta del PMQ nelle urine sintetiche è nella gamma nanomolare. Inoltre, questo metodo ha mostrato un grande potenziale per la quantificazione di PMQ da campioni di siero umano a concentrazioni clinicamente rilevanti. In questo protocollo, descriveremo i dettagli tecnici riguardanti le sintesi e la caratterizzazione dei prodotti azo colorati, la preparazione del reagente e le procedure per la determinazione del PMQ.
Introduction
PMQ è uno dei più importanti farmaci antimalarici, funziona non solo come uno schizontocidio tissutale per prevenire le ricadute, ma anche come un gametocitocide per interrompere la trasmissione della malattia1,2,3,4. L’emolisi intravascolare è uno degli effetti collaterali relativi al PMQ, che diventa estremamente grave in quelli carenti in G6PD. È noto che la malattia genetica del G6PD è distribuita in tutto il mondo con una frequenza genica tra il 3-30% nelle aree endemiche della malaria. La gravità della debolezza della PMQ dipende dal grado di carenza di G6PD, nonché dalla dose e dalla durata dell’esposizione al PMQ5,6. Per ridurre il rischio, l’OMS ha raccomandato una singola dose bassa (0,25 mg di base/kg) di PMQ per il trattamento della malaria. Tuttavia, questo è ancora messo in discussione dalle variazioni nella sensibilità del farmaco paziente5,7. Il monitoraggio della dose è necessario per valutare la farmacocinetica dopo la somministrazione di PMQ, che può effettuare la regolazione del dosaggio per un trattamento di successo con tossicità limitata.
La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è la tecnica più utilizzata per la determinazione clinica del PMQ. Endoh et al. ha segnalato un sistema HPLC con un rilevatore UV per la quantificazione del siero PMQ utilizzando una colonna8 . Nel loro sistema, le proteine del siero sono state prima precipitate con acetonitrile, e poi il PMQ nel supernatanto è stato separato per HPLC. La curva di calibrazione era lineare sull’intervallo di concentrazione da 0,01-1,0 g/mL8. Un altro metodo basato su un HPLC in fase inversa con rilevamento UV a 254 nm è stato segnalato per la quantificazione del PMQ e dei suoi principali metaboliti9. La curva di calibrazione per PMQ era lineare nell’intervallo compreso tra 0,025 e 100 g/mL. Un’ulteriore estrazione liquida-liquido con eano e acetato etilico misto come fase organica è stata utilizzata per la separazione PMQ con recupero percentuale raggiunto all’89%9. Più di recente, Miranda e altri hanno sviluppato un metodo UPLC con rilevamento UV a 260 nm per l’analisi PMQ nelle formulazioni delle compresse con un limite di rilevamento a 3 g/mL10.
Anche se i metodi HPLC mostrano una sensibilità promettente nella determinazione della droga e la sensibilità può essere ulteriormente migliorata se l’HPLC è dotato di uno spettrometro di massa, ci sono ancora alcuni svantaggi. Le misurazioni dirette dei farmaci nei fluidi biologici sono solitamente inaccessibili dall’HPLC, poiché molte biomolecole possono influenzare notevolmente l’analisi. Ulteriori estrazioni sono necessarie per rimuovere le molecole endogene prima dell’analisi HPLC11,12. Inoltre, il rilevamento PMQ da parte di un rilevatore HPLC-UV viene in genere eseguito alla sua lunghezza d’onda massima di assorbimento (260 nm).; tuttavia, ci sono molte molecole endogene nei fluidi biologici con una forte assorbimento a 260 nm (ad esempio, aminoacidi, vitamine, acidi nucleici e pigmenti uromedi), interferendo così con il rilevamento UV PMQ. È necessario sviluppare metodi semplici ed economici per la determinazione del PMQ con ragionevole sensibilità e selettività.
La reazione di Griess è stata presentata per la prima volta nel 1879 come test colorimetrico per il rilevamento dei nitriti13,14,15,16. Recentemente, questa reazione è stata ampiamente esplorata per rilevare non solo il nitrito, ma anche altre molecole biologicamente rilevanti17,18,19,20. In precedenza abbiamo riportato il primo studio sistematico di una reazione inaspettata di Griess con PMQ(Figura 1). In questo sistema, PMQ è in grado di formare azoi colorati quando accoppiato con aniline sostituite in presenza di ioni nitriti in condizioni acide. Abbiamo inoltre scoperto che il colore degli azoi variava dal giallo al blu quando aumentava l’effetto di donazione di elettroni del sostituendore su aniline21. Un metodo colorimetrico basato sull’assorbimento UV-vis per la quantificazione del PMQ è stato sviluppato attraverso la reazione ottimizzata tra 4-methoxyaniline e PMQ. Questo metodo ha mostrato un grande potenziale per il rilevamento sensibile e selettivo del PMQ nei fluidi bio-rilevanti. In questo caso, il nostro obiettivo è descrivere le procedure dettagliate per la determinazione del PMQ sulla base di questa strategia colorimetrica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo descritto un metodo colorimetrico per una comoda quantificazione PMQ. È potenzialmente il metodo attuale più semplice ed economico. Ancora più importante, questo metodo offre la misurazione basata su PMQ ad occhio nudo senza utilizzare alcuna apparecchiatura.
La reazione Griess ottimizzata per il rilevamento PMQ può generare un azo di colore rosso con un massimo assorbimento a 504 nm. La potenziale influenza derivante dall’assorbimento UV-vis è limitata, rendendo così il metodo p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono la Start-Up Grant dell’Università di Medicina Cinese di Guangzhou e il progetto di formazione per la ricerca scientifica per i giovani di G’UMCm (2019QNPY06). Riconosciamo anche il Lingnan Medical Research Center dell’Università di Medicina Cinese di Guangzhou per il supporto sulle strutture.
Materials
| 4-Methoxyaniline | Aladdin | K1709027 | |
| 2,4-Dimethoxyaniline | Heowns | 10154207 | |
| 3,4-Dimethoxyaniline | Bidepharm | BD21914 | |
| 4-Methylaniline | Adamas-beta | P1414526 | |
| 4-Nitroaniline | Macklin | C10191447 | |
| 96-wells,Flat Botton | Labserv | 310109008 | |
| Gaussian@16 software | Gaussian, Inc | Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux | |
| Hydrochloric acid | GCRF | 20180902 | |
| Marvin sketch (software) | CHEMAXON | free edition: 15.6.29 | |
| Phosphoric acid | Macklin | C10112815 | |
| Primaquine bisiphosphate | 3A Chemicals | CEBK200054 | |
| Sodium nitrite | Alfa Aesar | 5006K18R | |
| Sulfonamides | TCI(shanghai) | GCPLO-BP | |
| Varioskan LUX Plate reader | Thermo Fisher | Supplied with SkanIt Software 4.1 |
References
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