Réaction optimisée de Griess pour UV-Vis et détermination à l'œil nu de la primaquine antipaludique
Summary
Ce protocole décrit une nouvelle méthode colorimétrique pour la détection de primaquine antipaludique (PMQ) dans les urines synthétiques et les sérums humains.
Abstract
Primaquine (PMQ), un médicament antipaludique important, a été recommandé par l’Organisation mondiale de la Santé (OMS) pour le traitement des infections potentiellement mortelles causées par P. vivax et ovale. Cependant, PMQ a des effets indésirables indésirables qui mènent à l’hémolyse aigue dans les patients présentant l’insuffisance de déshydrogénase de glucose-6-phosphate (G6PD). Il est nécessaire de mettre au point des méthodes simples et fiables pour la détermination du PmQ dans le but de surveiller la posologie. Au début de 2019, nous avons signalé une approche basée sur les UV-Vis et les yeux nus pour la quantification colorimétrique DU PMQ. La détection a été basée sur une réaction de Griess-like entre PMQ et anilines, qui peut générer des produits azo colorés. La limite de détection pour la mesure directe du PMQ dans l’urine synthétique est dans la gamme nanomolaire. En outre, cette méthode a montré un grand potentiel pour la quantification de PMQ des échantillons de sérum humain aux concentrations médicalement pertinentes. Dans ce protocole, nous décrirarons les détails techniques concernant les synthèses et la caractérisation des produits azo colorés, la préparation de réactif, et les procédures pour la détermination de PMQ.
Introduction
PMQ est l’un des médicaments antipaludiques les plus importants, il fonctionne non seulement comme un schizontocide tissulaire pour prévenir la rechute, mais aussi comme un gametocytocide pour interrompre la transmission de la maladie1,2,3,4. L’hémolyse intravasculaire est l’un des effets secondaires préoccupants du PMQ, qui devient extrêmement grave chez les personnes déficientes en G6PD. On sait que le trouble génétique G6PD est distribué dans le monde entier avec une fréquence génétique comprise entre 3 et 30% dans les zones d’endémie palustre. La gravité de la faiblesse du PMQ dépend du degré d’insuffisance de G6PD aussi bien que de la dose et de la durée de l’exposition de PMQ5,6. Pour réduire le risque, l’OMS a recommandé une seule dose faible (0,25 mg de base/kg) de PMQ pour le traitement du paludisme. Cependant, cela est encore contesté par les variations dans la sensibilité aux médicaments des patients5,7. La surveillance de dose est nécessaire pour évaluer les pharmacocinétiques après administration de PMQ, qui peut affecter l’ajustement de dosage pour un traitement réussi avec la toxicité limitée.
La chromatographie liquide de haute performance (HPLC) est la technique la plus largement utilisée pour la détermination clinique de PMQ. Endoh et coll. ont signalé un système HPLC avec un détecteur UV pour la quantification du sérum PMQ à l’aide d’une colonne de gel de polymère C-188. Dans leur système, les protéines sériques ont d’abord été précipitées avec de l’acétonitrile, puis le PMQ dans le supernatant a été séparé pour HPLC. La courbe d’étalonnage était linéaire sur la plage de concentration de 0,01 à 1,0 g/mL8. Une autre méthode basée sur un HPLC en phase inverse avec détection UV à 254 nm a été rapportée pour la quantification du PMQ et de ses principaux métabolites9. La courbe d’étalonnage du PMQ était linéaire dans la fourchette comprise entre 0,025-100 g/mL. Une extraction liquide-liquide supplémentaire avec l’hexane mélangé et l’acétate d’éthyle comme phase organique a été employée pour la séparation de PMQ avec la récupération de pourcentage a atteint 89%9. Plus récemment, Miranda et coll. ont mis au point une méthode UPLC avec détection UV à 260 nm pour l’analyse de PMQ dans les formulations de comprimés avec une limite de détection à 3 ‘g/mL10.
Bien que les méthodes HPLC présentent une sensibilité prometteuse dans la détermination des médicaments et que la sensibilité puisse être encore améliorée si le HPLC est équipé d’un spectromètre de masse, il y a encore quelques inconvénients. Les mesures directes des médicaments dans les fluides biologiques sont généralement inaccessibles par HPLC, car de nombreuses biomolécules peuvent grandement influencer l’analyse. Des extractions supplémentaires sont nécessaires pour enlever les molécules endogènes avant l’analyse HPLC11,12. De plus, la détection de PMQ par un détecteur HPLC-UV est généralement effectuée à sa longueur d’onde maximale d’absorption (260 nm); cependant, il existe de nombreuses molécules endogènes dans les fluides biologiques avec une forte absorption à 260 nm (par exemple, acides aminés, vitamines, acides nucléiques et pigments urochromes), interférant ainsi avec la détection DES UV PMQ. Il est nécessaire d’élaborer des méthodes simples et rentables pour la détermination du PmQ avec une sensibilité et une sélectivité raisonnables.
La réaction de Griess a été présentée pour la première fois en 1879 comme un test colorimétrique pour la détection des nitrites13,14,15,16. Récemment, cette réaction a été largement explorée pour détecter non seulement le nitrite mais aussi d’autres molécules biologiquement pertinentes17,18,19,20. Nous avons déjà signalé la première étude systématique d’une réaction inattendue de Griess avec PMQ (figure 1). Dans ce système, PMQ est capable de former des azos colorés lorsqu’ils sont couplés avec des anilines substituées en présence d’ions nitrite s’ils sont acides. Nous avons en outre constaté que la couleur des azos variait du jaune au bleu lors de l’augmentation de l’effet de don d’électrons du substituant sur les anilines21. Une méthode colorimétrique basée sur l’absorption UV-vis pour la quantification de PMQ a été développée par la réaction optimisée entre 4-methoxyaniline et PMQ. Cette méthode a montré un grand potentiel pour la détection sensible et sélective du PMQ dans les fluides bio-pertinents. Ici, nous visons à décrire les procédures détaillées pour la détermination PMQ basée sur cette stratégie colorimétrique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons décrit une méthode colorimétrique pour la quantification commode de PMQ. C’est potentiellement la méthode actuelle la plus simple et la plus rentable. Plus important encore, cette méthode offre permet la mesure à l’œil nu PMQ sans utiliser d’équipement.
La réaction optimisée de Griess pour la détection de PMQ peut générer un azo de couleur rouge avec une absorption maximale à 504 nm. L’influence potentielle de l’absorption UV-vis des biomolécules endogènes est limit?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent la subvention de démarrage de l’Université de médecine chinoise de Guangzhou et le projet de formation à la recherche scientifique pour les jeunes de GZUCM (2019QNPY06). Nous reconnaissons également le Centre de recherche médicale de Lingnan de l’Université de médecine chinoise de Guangzhou pour le soutien sur les installations.
Materials
| 4-Methoxyaniline | Aladdin | K1709027 | |
| 2,4-Dimethoxyaniline | Heowns | 10154207 | |
| 3,4-Dimethoxyaniline | Bidepharm | BD21914 | |
| 4-Methylaniline | Adamas-beta | P1414526 | |
| 4-Nitroaniline | Macklin | C10191447 | |
| 96-wells,Flat Botton | Labserv | 310109008 | |
| Gaussian@16 software | Gaussian, Inc | Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux | |
| Hydrochloric acid | GCRF | 20180902 | |
| Marvin sketch (software) | CHEMAXON | free edition: 15.6.29 | |
| Phosphoric acid | Macklin | C10112815 | |
| Primaquine bisiphosphate | 3A Chemicals | CEBK200054 | |
| Sodium nitrite | Alfa Aesar | 5006K18R | |
| Sulfonamides | TCI(shanghai) | GCPLO-BP | |
| Varioskan LUX Plate reader | Thermo Fisher | Supplied with SkanIt Software 4.1 |
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