UV-Visに対する最適化されたグリース反応と抗マラリアプリマキンの肉眼判定
Summary
このプロトコルは、合成尿およびヒト血清における抗マラリアプリマキン(PMQ)検出のための新しい色分法について説明する。
Abstract
重要な抗マラリア薬であるプリマキン(PMQ)は、P.vivaxおよび楕円形によって引き起こされる生命を脅かす感染症の治療のために世界保健機関(WHO)によって推奨されている。しかし、PMQは、グルコース-6-リン酸脱水素酵素(G6PD)欠乏症患者の急性消読につながる望ましくない副作用を有する。投与量モニタリングを目的としたPMQ判定のための簡素で信頼性の高い方法を開発する必要がある。2019年初頭には、PMQ色分化のUV-Visと肉眼ベースのアプローチを報告しました。検出は、色付きのアゾ製品を生成することができるPMQとアニリンの間のグリースのような反応に基づいていました。合成尿中のPMQの直接測定のための検出限界は、ナノモルの範囲にある。さらに、この方法は、臨床的に関連する濃度でヒト血清サンプルからのPMQ定量に大きな可能性を示した。このプロトコルでは、着色アゾ製品の合成と特性に関する技術的な詳細、試薬の調製、およびPMQ決定の手順について説明します。
Introduction
PMQは、最も重要な抗マラリア薬の一つであり、再発を防ぐための組織シゾントシクシドとしてだけでなく、疾患の伝染を中断するゲームトサイトシトシドとしても機能する1、2、3、4。血管内出血は、G6PDの欠乏に非常に深刻になるPMQの副作用に関する一つである。G6PD遺伝性疾患は、マラリア流行地域で3〜30%の間の遺伝子頻度で世界中に分布していることが知られています。PMQ弱さの重症度は、G6PD欠乏の程度だけでなく、用量とPMQ暴露5、6の持続時間に依存する。リスクを下げるために、WHOはマラリア治療のためにPMQの単一の低用量(0.25 mg塩基/kg)を推奨しています。しかし、これは依然として患者薬物感受性5、7の変動によって挑戦される。用量モニタリングは、PMQ投与後の薬物動態を評価するために必要であり、これは限られた毒性を有する治療の成功のための投与量調整に影響を与える可能性がある。
高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)は、PMQ臨床決定のために最も広く使用されている技術です。Endohらは、C-18ポリマーゲルカラム8を用いた血清PMQ定量用UV検出器を用いたHPLCシステムを報告した。彼らのシステムでは、血清タンパク質は最初にアセトニトリルで沈殿し、次いで上清中のPMQをHPLCのために分離した。キャリブレーション曲線は0.01-1.0 μg/mL8の濃度範囲にわたって線形であった。254 nmでのUV検出を有する逆相HPLCに基づく別の方法は、PMQおよびその主要代謝産物9の定量のために報告されている。PMQのキャリブレーション曲線は0.025~100 μg/mLの範囲で直線的であった。有機相としてヘキサンと酢酸エチルを混合した追加の液体液抽出を使用し、PMQ分離に使用し、回収率は89%9に達した。さらに最近では、ミランダらが3μg/mL10で検出限界を持つ錠剤製剤におけるPMQ分析用の260nmでUV検出を用いてUPLC法を開発した。
HPLC法は薬剤決定において有望な感度を示し、HPLCが質量分析計を装備すれば感度はさらに向上するが、それでもいくつかの欠点がある。多くの生体分子が分析に大きな影響を与える可能性があるため、生体液中の直接薬物測定は通常HPLCではアクセスできません。HPLC分析11、12の前に内因性分子を除去するために追加の抽出が必要です。さらに、HPLC-UV検出器によるPMQ検出は、通常、その最大吸収波長(260nm)で行われる。しかし、260nm(アミノ酸、ビタミン、核酸、ウロクロム顔料など)で強い吸光度を持つ生体液には多くの内因性分子があり、PMQ UV検出を妨げています。合理的な感度と選択性を持つPMQ判定のためのシンプルで費用対効果の高い方法を開発する必要があります。
Griess反応は、亜硝酸塩検出13、14、15、16の色分け試験として1879年に最初に提示された。最近、この反応は、亜硝酸塩だけでなく、他の生物学的に関連する分子17、18、19、20を検出するために広範囲に探索されている。我々は以前にPMQとの予期しないグリース反応の最初の系統的研究を報告しました(図1)。このシステムでは、PMQは、酸性条件下で亜硝酸イオンの存在下で置換されたアニリンと組み合わせると着色アゾを形成することができる。さらに、アニリン21上の置換の電子寄付効果を高めると、アゾスの色が黄色から青色に変化することがわかった。PMQ定量のためのUV-vis吸収ベースの色彩測定法は、4-メトキシアニリンとPMQの間の最適化された反応を通じて開発されました。この方法は、生体関連流体におけるPMQの感受性および選択的検出に大きな可能性を示した。ここでは、この色彩戦略に基づいてPMQ判定の詳細な手順を説明することを目的とする。
Protocol
Representative Results
Discussion
便利なPMQ定量のための色彩法について述べた。これは、潜在的に最もシンプルで費用対効果の高い現在の方法です。さらに重要なことに、この方法は、任意の機器を使用せずに肉眼ベースのPMQ測定を可能にします。
PMQ検出用に最適化されたGriess反応は、504 nmで最大吸収性の赤色アゾを生成することができます。内因性生体分子のUV-vis吸収による潜在的な影響は限られて?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、広州中国医学大学のスタートアップ助成金とGZUCMの青少年科学研究研修プロジェクト(2019QNPY06)を認めている。また、広州中国医学大学の寧南医学研究センターが施設の支援を行っていることも認めます。
Materials
| 4-Methoxyaniline | Aladdin | K1709027 | |
| 2,4-Dimethoxyaniline | Heowns | 10154207 | |
| 3,4-Dimethoxyaniline | Bidepharm | BD21914 | |
| 4-Methylaniline | Adamas-beta | P1414526 | |
| 4-Nitroaniline | Macklin | C10191447 | |
| 96-wells,Flat Botton | Labserv | 310109008 | |
| Gaussian@16 software | Gaussian, Inc | Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux | |
| Hydrochloric acid | GCRF | 20180902 | |
| Marvin sketch (software) | CHEMAXON | free edition: 15.6.29 | |
| Phosphoric acid | Macklin | C10112815 | |
| Primaquine bisiphosphate | 3A Chemicals | CEBK200054 | |
| Sodium nitrite | Alfa Aesar | 5006K18R | |
| Sulfonamides | TCI(shanghai) | GCPLO-BP | |
| Varioskan LUX Plate reader | Thermo Fisher | Supplied with SkanIt Software 4.1 |
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