プパル期のショウジョウバエ上皮の組織オリエンテーションと成長ダイナミクスのイメージングと解析
Summary
このプロトコルは、ショウジョウバエが変態を受ける中、ショウジョウバエ腹部上皮の細胞配向および組織成長のダイナミクスのイメージングと分析のために設計されています。ここで説明する方法論は、ショウジョウバエまたは他のモデル生物における異なる発達段階、組織、および細胞下構造の研究に適用することができる。
Abstract
多細胞生物の中では、成熟した組織や器官は、その構成細胞の空間的配置において高い秩序を示す。顕著な例は、同一または異なる同一の同一のアイデンティティの細胞が非常に組織化された平面パターンを示す細胞細胞接着を介して一緒に持ち込まれる感覚上皮によって与えられる。セルは互いに同じ方向に整列し、大きな距離で同等の極性を表示します。成熟した上皮のこの組織は、形態形成の過程で確立される。成熟した上皮の平面配置がどのように達成されるのかを理解するためには、生体内での発達中に高い時空間的忠実度を持つ細胞の配向と成長ダイナミクスを追跡することが重要である。また、ローカルからグローバルへの移行を特定して特徴付けるためには、堅牢な分析ツールも不可欠です。ショウジョウバエウは、上皮形態形成の根底にある配向細胞形状の変化を評価するのに理想的なシステムである。上皮を発達するプパルは、不移動体の外部表面を構成し、無傷の動物の長期イメージングを可能にする。ここで説明するプロトコルは、成長するに従って、プパル腹部表皮のグローバルレベルと局所レベルの両方で細胞の挙動を画像化し、分析するように設計されています。記載された方法論は、他の発達段階、組織、細胞内構造、またはモデル生物における細胞行動のイメージングに容易に適応することができる。
Introduction
その役割を達成するために、上皮組織は細胞成分の空間的組織に完全に依存している。ほとんどの上皮では、細胞は正確な石畳層を作り出すために互いに詰め合われているだけでなく、身体の軸に対して自分自身を向いています。
正確な組織組織の機能的重要性は、脊椎動物の内耳や陰部などの感覚上皮において明らかである。最初のケースでは、ヘアセルと支持セルは特定の軸方向に整列し、音や動き11、22などの機械的入力を効率的に感知します。同様に、感光体細胞空間組織は、レチナ3による最適な光学特性を達成するために不可欠である。細胞の位置と向きの空間的制御は、したがって、適切な生理機能のための特に関連性のである。
ショウジョウバエは、変態を通じて幼虫の体構造の完全な変換を受け、その成体組織を生み出す正形虫である。ショウジョウバエプは、発達細胞遊走4、細胞分裂および成長ダイナミクス5、筋収縮6、細胞死7、創傷修復8、および細胞配向9を含む様々な動的事象の非侵襲的なライブイメージングのための優れたモデルである。成体ショウジョウバエでは、外的上皮は高度な秩序を示す。これは、毛状突起(すなわち、単一の上皮細胞から生じる細胞突起)およびハエの体表面10の上の感覚毛の配置に容易に観察される。実際、毛状突起は、空気流11を導く平行な行に整列されている。成体上皮の形態形成と個々の細胞の秩序ある配置は、胚発生の間に始まり、プパル段階で最高潮に達する。胚細胞分裂、インターカレーション、および形状変化はすべて組織オーダー12、13を減少させるが、13これは発達の後期段階で、特に子犬の段階では、フライが成熟期9に近づくと戻される。
不移動性ショウジョウバの子犬は、細胞の形状および向きの変化を評価するのに理想的なシステムを提供する。パパル腹部表皮は特別な利点を提示する。成人頭部、胸郭、生殖器、および付属物の前駆体が成長し、幼虫段階からパターン化される一方で、幼虫表皮に統合されたヒストラストは、子犬14時にのみ成長し、分化し始める。この機能は、組織の秩序の確立に関与するすべての時空間的事象を完全に追跡することを可能にする 9.
ヒストブラストは、各推定腹部セグメントの対側位置で胚発生中に指定される。成人の背部腹部表皮は、前部および後部区画15,16,16に存在する背部位置ヒストブラスト巣に由来する。ヒスト芽細胞が拡大するにつれて、幼虫上皮細胞(LED)を置き換えると、反側の巣は、コンフルエントシート17、18、19、20,19,を形成する背側中線で融合する。17,20
この研究は、1)ショウジョウバエの解剖、取り付け、および長期ライブイメージングのための方法論、および2)高い時空間分解能における細胞の向きおよび成長のダイナミクスを研究する分析方法を説明する。ここでは、初期の子犬の準備(すなわち、ステージングおよびイメージング)から方向性および方向の特徴の抽出および定量化に必要なすべてのステップをカバーする詳細なプロトコルが提供されています。また、細胞クローンの解析から局所組織特性を推測する方法についても述べている。記載されているすべてのステップは、最小限の侵襲的であり、長期的なライブ分析を可能にします。ここで説明する方法は、容易に適応し、他の発達段階、組織、またはモデル生物に適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
長距離オーダーは、ほとんどの機能生理学的単位の必須特性である。形態形成の間、秩序は高い時間的および空間的精密と実施される複雑な命令の統合によって達成される。複数および多レベルの制約は、ステレオタイプ組織の配置に統合されています。
開発時の秩序空間配置には極性と方向性が重要です。極性は、発達中の対称性の破断を意味します。非対称性の達?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
マルティン・ブランコ研究所のメンバーに感謝申し上げられる。また、ニック・タポン(英国ロンドン・クリック研究所)、ブルーミントン・ストック・センター(米国インディアナ大学)、FlyBase(ショウジョウバエ遺伝子注釈用)にも感謝します。フェデリカ・マンジョーネはJAE-CSICの博士研究員によって支えられました。マルティン・ブランコ研究所は、プログラム・エスタタル・デ・フォメント・デ・ラ・インベスティガシオン・シエンティフィカ・イ・テクニカ・デ・エクセレンシア(BFU2014-57019-PおよびBFU2017-82876-P)とフンダシオン・ラモン・アレススから資金提供を受けました。
Materials
| Analysis Software | – | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | – | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | – | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
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