Изображение и анализ ориентации тканей и динамики роста в развивающихся дрозофилы Эпителия во время Pupal Этапы
Summary
Этот протокол предназначен для визуализации и анализа динамики клеточной ориентации и роста тканей в эпидемии брюшной полости Drosophila, поскольку плодовая муха подвергается метаморфозе. Описанная здесь методология может быть применена к изучению различных стадий развития, тканей и субклеточных структур в дрозофиле или других модельных организмах.
Abstract
В многоклеточных организмах зрелые ткани и органы демонстрируют высокую степень порядка в пространственных расположениях их составных клеток. Замечательный пример приводится сенсорной эпителии, где клетки же или различных идентичностей собираются вместе через клеточные клетки слипа с указанием высокоорганизованных планарных моделей. Клетки выравниваются друг с другом в том же направлении и отображают эквивалентную полярность на больших расстояниях. Эта организация зрелой эпителии устанавливается в течение морфогенеза. Чтобы понять, как достигается планарное расположение зрелой эпителии, важно отслеживать ориентацию клеток и динамику роста с высокой пространственно-временной точностью во время развития in vivo. Надежные аналитические инструменты также необходимы для выявления и характеристики переходов на местном к глобальному характеру. Дрозофила куколка является идеальной системой для оценки ориентированных изменений формы клеток, лежащих в основе эпителиального морфогенеза. Pupal развивающихся эпителий представляет собой внешнюю поверхность неподвижного тела, что позволяет долгосрочное изображение нетронутых животных. Описанный здесь протокол предназначен для изображения и анализа поведения клеток как на глобальном, так и на местном уровне в эпидермисе брюшной полости pupal по мере его роста. Описанная методология может быть легко адаптирована к визуализации клеточного поведения на других стадиях развития, тканях, субклеточных структурах или модельных организмах.
Introduction
Для достижения своей роли эпителиальные ткани полностью полагаются на пространственную организацию своих клеточных компонентов. В большинстве эпителий клетки не только упакованы друг против друга, чтобы создать точный слой булыжника, но они ориентируются относительно осей тела.
Функциональное значение точной организации тканей очевидно в сенсорных эпителиях, таких как позвоночное внутреннее ухо и сетчатка. В первом случае волосы и поддерживающие клетки выравниваются в определенном осевом направлении, чтобы эффективно чувствовать механические входы, такие как звук и движение1,2. Аналогичным образом, фоторецептор клеточной пространственной организации имеет важное значение для достижения оптимальных оптических свойств сетчатки3. Таким образом, пространственный контроль положения и ориентации клеток имеет особое значение для правильной физиологической функции.
Дрозофила является голометаболическим насекомым, которое претерпевает полное преобразование своих личинок структуры тела через метаморфозы, что приводит к его взрослых тканей. Дрозофила кукапа является отличной моделью для неинвазивных живой визуализации различных динамических событий, в том числе миграции клетокразвития 4, деление клеток и динамика роста5, сокращение мышц6, гибель клеток7, ремонт раны 8, и ориентация клеток9. У взрослой дрозофилы, внешний эпителий показывает высокую степень порядка. Это легко наблюдается на расположения трихом (т.е. выступы клеток, происходящих из отдельных эпителиальных клеток) и сенсорных щетины по всей поверхности тела мухи10. Действительно, трихом выровнены в параллельных рядах, направляющих воздушный поток11. Морфогенез эпителии взрослых и упорядоченное расположение отдельных клеток начинается во время эмбриогенеза и завершается во время стадии pupal. В то время как в эмбрионах клеточные деления, интеркалации и формы изменяют все уменьшающееся предельное управление ткани12,,13, это возвращается на более поздних стадиях развития, особенно на стадиях pupal, когда муха приближается к зрелости9.
Неподвижный кукачанка Drosophila обеспечивает идеальную систему для оценки формы клеток и изменения ориентации. Особой преимуществаю является эпидермис брюшной полости. В то время как предшественники взрослой головы, грудной клетки, гениталий и придатков растут и получают узоризм из личинок этапов, гистопласты, которые интегрированы в личиночной эпидермис, начинают расти и дифферециации только при pupariation14. Эта функция позволяет отслеживать все пространственно-временные события, участвующие в создании порядка тканей в полном объеме9.
Гистобласты определяются во время эмбрионального развития на контралатеральных позициях в каждом предполагаемом брюшном сегменте. В рознические брюшной эпидермис взрослого происходит от дорсолатерально расположен гистобласт гнезда, присутствующие в передней и задней отсеков15,16. По мере расширения гистопластов, заменяющих личиночные эпителиальные клетки (ЛЭК), контралатеральные гнезда предохраняют на дозорной средней линии, образуя конфлюентный лист17,,18,,19,20.
Эта работа описывает 1) методологию для вскрытия, монтажа и долгосрочной живой визуализации кукота Drosophila, и 2) аналитические методы для изучения динамики клеточной ориентации и роста при высоком пространственно-временном разрешении. Здесь представлен подробный протокол, охватывающий все шаги, необходимые от первоначальной подготовки куколок (т.е. постановки и визуализации) до извлечения и количественной оценки функций направленности и ориентации. Мы также описываем, как сделать вывод о местных свойствах тканей из анализа клеточных клонов. Все описанные шаги являются минимально инвазивными и позволяют проводить долгосрочный живой анализ. Описанные здесь методы могут быть легко адаптированы и применены к другим стадиям развития, тканям или модельным организмам.
Protocol
Representative Results
Discussion
Дальнобойный порядок является важной характеристикой большинства функциональных физиологических единиц. Во время морфогенеза порядок достигается за счет интеграции сложных инструкций, реализованных с высокой временной и пространственной точностью. Многоуровневые ограничения инт?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить сотрудников лаборатории Мартин-Бланко за полезные обсуждения. Мы также благодарим Ника Тапона (Институт Крика, Лондон, Великобритания), Блумингтонский фондовый центр (Университет Индианы, США) и FlyBase (за аннотацию гена Дрозофилы). Федерика Манджоне была поддержана JAE-CSIC предварительной стипендий. Лаборатория Мартина-Бланко финансировалась из Программы Estatal de Fomento de la Investigacion Cientefica y T’cnica de Excelencia (BFU2014-57019-P и BFU2017-82876-P) и из Фонда Рамона Аресеса.
Materials
| Analysis Software | – | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | – | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | – | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae. Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).
- Stell, W. K. The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus. Comparative Biochemistry and Physiology – Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336, 724-727 (2012).
- Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
- Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium. Development. 144, 95-105 (2017).
- Weavers, H., et al. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).
- Mangione, F., Martin-Blanco, E. The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen. Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).
- Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. Developmental compartments and planar polarity in Drosophila. Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).
- Wootton, R. How flies fly. Nature. 400, 112-113 (1999).
- Zallen, J. A., Wieschaus, E. Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila. Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).
- Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux’s archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).
- Kornberg, T. Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus. Biologie du développement. 86, 363-372 (1981).
- Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. Clonal parameters of tergite development in Drosophila. Biologie du développement. 26, 264-276 (1971).
- Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux’s archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).
- Madhavan, M. M., Madhavan, K. Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Fonck, E., et al. Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries. Stroke. 40, 2552-2556 (2009).
- Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).
- Hammer, &. #. 2. 1. 6. ;., Harper, D. A., Ryan, P. D. PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).
- Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity. Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).
- Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity. Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).
- Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension. Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).
- Martin-Blanco, E., et al. puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila. Genes and Development. 12, 557-570 (1998).
- Dye, N. A., et al. Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc. Development. 144, 4406-4421 (2017).
- Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis. Development. 124, 2889-2901 (1997).
- Ferguson, M. W. Palate development. Development. 103, 41-60 (1988).
