Imagem e Análise da Dinâmica de Orientação e Crescimento tecidual na Epitélia Drosophila em Desenvolvimento durante os estágios pupal
Summary
Este protocolo é projetado para a imagem e análise da dinâmica da orientação celular e crescimento tecidual na epitélia abdominal Drosophila à medida que a mosca-das-frutas sofre metamorfose. A metodologia aqui descrita pode ser aplicada ao estudo de diferentes estágios de desenvolvimento, tecidos e estruturas subcelulares em Drosophila ou outros organismos modelo.
Abstract
Dentro de organismos multicelulares, tecidos e órgãos maduros apresentam altos graus de ordem nos arranjos espaciais de suas células constituintes. Um exemplo notável é dado pela epitélio sensorial, onde células das mesmas ou distintas identidades são reunidas através da adesão celular mostrando padrões planares altamente organizados. As células se alinham umas com as outras na mesma direção e exibem polaridade equivalente em grandes distâncias. Esta organização da epithelia madura é estabelecida ao longo da morfogênese. Para entender como o arranjo planar da epitélia madura é alcançado, é fundamental acompanhar a orientação celular e a dinâmica de crescimento com alta fidelidade espostetal durante o desenvolvimento in vivo. Ferramentas analíticas robustas também são essenciais para identificar e caracterizar transições locais para globais. A drosophila pupa é um sistema ideal para avaliar mudanças de forma celular orientadas subjacentes à morfogênese epitelial. O epitélio em desenvolvimento pupal constitui a superfície externa do corpo imóvel, permitindo imagens de longo prazo de animais intactos. O protocolo descrito aqui é projetado para imagem e análise de comportamentos celulares em níveis globais e locais na epiderme abdominal pupal à medida que cresce. A metodologia descrita pode ser facilmente adaptada à imagem de comportamentos celulares em outros estágios de desenvolvimento, tecidos, estruturas subcelulares ou organismos modelo.
Introduction
Para alcançar seus papéis, os tecidos epiteliais dependem totalmente da organização espacial de seus componentes celulares. Na maioria das epitélios, as células não são apenas embaladas umas contra as outras para criar uma camada precisa de paralelepípedos, mas elas se orientam em relação aos eixos do corpo.
A importância funcional da organização precisa do tecido é óbvia na epitélio sensorial, como o ouvido interno vertebrado e a retina. No primeiro caso, as células de cabelo e suporte se alinham em uma direção axial específica para sentir eficientemente entradas mecânicas como som e movimento1,,2. Da mesma forma, a organização espacial celular fotorreceptora é essencial para alcançar propriedades ópticas ideais pela retina3. O controle espacial da posição e orientação celular é, portanto, de particular relevância para a função fisiológica adequada.
Drosophila é um inseto holometaboloso que sofre uma transformação completa de suas estruturas corporais larvais através da metamorfose, dando origem aos seus tecidos adultos. A pupa Drosophila é um excelente modelo para a imagem ao vivo não invasiva de uma variedade de eventos dinâmicos, incluindo migração celular de desenvolvimento4, divisão celular e dinâmica de crescimento5,contração muscular6,morte celular7,reparação de feridas8e orientação celular9. Na Drosophilaadulta, o epitélio externo mostra um alto grau de ordem. Isso é facilmente observado nos arranjos de trichomes (ou seja, saliências celulares originárias de células epiteliais únicas) e cerdas sensoriais por toda a superfície corporal da mosca10. De fato, as trichomes estão alinhadas em linhas paralelas que guiam o fluxo de ar11. A morfogênese da epitélio adulta e o arranjo ordenado das células individuais começa durante a embriogênese e culmina durante os estágios pupais. Enquanto em divisões celulares de embriões, intercalações e alterações de forma todas as alterações diminuem a ordem tecidual12,13, isso é revertido em estágios posteriores de desenvolvimento, especialmente em estágios pupais, quando a mosca se aproxima da maturidade9.
A pupa drosophila imóvel fornece um sistema ideal para avaliar as mudanças de forma e orientação celular. A epiderme abdominal pupal apresenta vantagens especiais. Enquanto os precursores da cabeça adulta, tórax, genitália e apêndices crescem e se padronizam a partir de estágios larvais, os histoblastos, que são integrados à epiderme larval, começam a crescer ediferenciar-se apenasna pupariação 14 . Este recurso permite o acompanhamento de todos os eventos espesso envolvidos no estabelecimento da ordem tecidual em sua totalidade9.
Os histoblastos são especificados durante o desenvolvimento embrionário em posições gerlaterais em cada segmento abdominal presuntivo. A epiderme abdominal dorsal do adulto deriva dos ninhos de histoblasto situados dorsolateramente presentes nos compartimentos anterior e posterior15,16. À medida que os histoblastos se expandem, substituindo as células epiteliais larvais (LECs), os ninhos contralaterais se fundem na linha média dorsal formando uma folha confluente17,,18,19,,20.
Este trabalho descreve 1) uma metodologia de dissecção, montagem e imagem ao vivo de longo prazo dos métodos analíticos Drosophila pupae e 2) para estudar a dinâmica da orientação celular e do crescimento em alta resolução espostetorial. Aqui é fornecido um protocolo detalhado, abrangendo todas as etapas necessárias desde a preparação inicial do pupae (ou seja, encenação e imagem) até a extração e quantificação das características de direcionalidade e orientação. Também descrevemos como inferir propriedades de tecidos locais a partir da análise de clones celulares. Todas as etapas descritas são minimamente invasivas e permitem análises ao vivo de longo prazo. Os métodos descritos aqui podem ser facilmente adaptados e aplicados a outros estágios de desenvolvimento, tecidos ou organismos modelo.
Protocol
Representative Results
Discussion
A ordem de longo alcance é uma característica essencial da maioria das unidades fisiológicas funcionais. Durante a morfogênese, a ordem é alcançada através da integração de instruções complexas implementadas com alta precisão temporal e espacial. Restrições múltiplas e multinível são integradas em arranjos teciduais estereotipados.
Polaridade e direcionalidade são fundamentais para o arranjo espacial ordenado durante o desenvolvimento. Polaridade implica quebra de simetria du…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Martín-Blanco por discussões úteis. Agradecemos também a Nic Tapon (The Crick Institute, Londres, Reino Unido), o Bloomington Stock Center (University of Indiana, EUA) e flybase (por anotação genética Drosophila). Federica Mangione foi apoiada por uma bolsa de pré-doutorado da JAE-CSIC. O laboratório Martín-Blanco foi financiado pelo Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P e BFU2017-82876-P) e da Fundação Ramón Areces.
Materials
| Analysis Software | – | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | – | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | – | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae. Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).
- Stell, W. K. The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus. Comparative Biochemistry and Physiology – Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336, 724-727 (2012).
- Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
- Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium. Development. 144, 95-105 (2017).
- Weavers, H., et al. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).
- Mangione, F., Martin-Blanco, E. The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen. Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).
- Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. Developmental compartments and planar polarity in Drosophila. Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).
- Wootton, R. How flies fly. Nature. 400, 112-113 (1999).
- Zallen, J. A., Wieschaus, E. Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila. Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).
- Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux’s archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).
- Kornberg, T. Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus. Biologie du développement. 86, 363-372 (1981).
- Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. Clonal parameters of tergite development in Drosophila. Biologie du développement. 26, 264-276 (1971).
- Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux’s archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).
- Madhavan, M. M., Madhavan, K. Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Fonck, E., et al. Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries. Stroke. 40, 2552-2556 (2009).
- Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).
- Hammer, &. #. 2. 1. 6. ;., Harper, D. A., Ryan, P. D. PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).
- Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity. Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).
- Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity. Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).
- Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension. Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).
- Martin-Blanco, E., et al. puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila. Genes and Development. 12, 557-570 (1998).
- Dye, N. A., et al. Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc. Development. 144, 4406-4421 (2017).
- Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis. Development. 124, 2889-2901 (1997).
- Ferguson, M. W. Palate development. Development. 103, 41-60 (1988).
