Este protocolo é projetado para a imagem e análise da dinâmica da orientação celular e crescimento tecidual na epitélia abdominal Drosophila à medida que a mosca-das-frutas sofre metamorfose. A metodologia aqui descrita pode ser aplicada ao estudo de diferentes estágios de desenvolvimento, tecidos e estruturas subcelulares em Drosophila ou outros organismos modelo.
Dentro de organismos multicelulares, tecidos e órgãos maduros apresentam altos graus de ordem nos arranjos espaciais de suas células constituintes. Um exemplo notável é dado pela epitélio sensorial, onde células das mesmas ou distintas identidades são reunidas através da adesão celular mostrando padrões planares altamente organizados. As células se alinham umas com as outras na mesma direção e exibem polaridade equivalente em grandes distâncias. Esta organização da epithelia madura é estabelecida ao longo da morfogênese. Para entender como o arranjo planar da epitélia madura é alcançado, é fundamental acompanhar a orientação celular e a dinâmica de crescimento com alta fidelidade espostetal durante o desenvolvimento in vivo. Ferramentas analíticas robustas também são essenciais para identificar e caracterizar transições locais para globais. A drosophila pupa é um sistema ideal para avaliar mudanças de forma celular orientadas subjacentes à morfogênese epitelial. O epitélio em desenvolvimento pupal constitui a superfície externa do corpo imóvel, permitindo imagens de longo prazo de animais intactos. O protocolo descrito aqui é projetado para imagem e análise de comportamentos celulares em níveis globais e locais na epiderme abdominal pupal à medida que cresce. A metodologia descrita pode ser facilmente adaptada à imagem de comportamentos celulares em outros estágios de desenvolvimento, tecidos, estruturas subcelulares ou organismos modelo.
Para alcançar seus papéis, os tecidos epiteliais dependem totalmente da organização espacial de seus componentes celulares. Na maioria das epitélios, as células não são apenas embaladas umas contra as outras para criar uma camada precisa de paralelepípedos, mas elas se orientam em relação aos eixos do corpo.
A importância funcional da organização precisa do tecido é óbvia na epitélio sensorial, como o ouvido interno vertebrado e a retina. No primeiro caso, as células de cabelo e suporte se alinham em uma direção axial específica para sentir eficientemente entradas mecânicas como som e movimento1,,2. Da mesma forma, a organização espacial celular fotorreceptora é essencial para alcançar propriedades ópticas ideais pela retina3. O controle espacial da posição e orientação celular é, portanto, de particular relevância para a função fisiológica adequada.
Drosophila é um inseto holometaboloso que sofre uma transformação completa de suas estruturas corporais larvais através da metamorfose, dando origem aos seus tecidos adultos. A pupa Drosophila é um excelente modelo para a imagem ao vivo não invasiva de uma variedade de eventos dinâmicos, incluindo migração celular de desenvolvimento4, divisão celular e dinâmica de crescimento5,contração muscular6,morte celular7,reparação de feridas8e orientação celular9. Na Drosophilaadulta, o epitélio externo mostra um alto grau de ordem. Isso é facilmente observado nos arranjos de trichomes (ou seja, saliências celulares originárias de células epiteliais únicas) e cerdas sensoriais por toda a superfície corporal da mosca10. De fato, as trichomes estão alinhadas em linhas paralelas que guiam o fluxo de ar11. A morfogênese da epitélio adulta e o arranjo ordenado das células individuais começa durante a embriogênese e culmina durante os estágios pupais. Enquanto em divisões celulares de embriões, intercalações e alterações de forma todas as alterações diminuem a ordem tecidual12,13, isso é revertido em estágios posteriores de desenvolvimento, especialmente em estágios pupais, quando a mosca se aproxima da maturidade9.
A pupa drosophila imóvel fornece um sistema ideal para avaliar as mudanças de forma e orientação celular. A epiderme abdominal pupal apresenta vantagens especiais. Enquanto os precursores da cabeça adulta, tórax, genitália e apêndices crescem e se padronizam a partir de estágios larvais, os histoblastos, que são integrados à epiderme larval, começam a crescer ediferenciar-se apenasna pupariação 14 . Este recurso permite o acompanhamento de todos os eventos espesso envolvidos no estabelecimento da ordem tecidual em sua totalidade9.
Os histoblastos são especificados durante o desenvolvimento embrionário em posições gerlaterais em cada segmento abdominal presuntivo. A epiderme abdominal dorsal do adulto deriva dos ninhos de histoblasto situados dorsolateramente presentes nos compartimentos anterior e posterior15,16. À medida que os histoblastos se expandem, substituindo as células epiteliais larvais (LECs), os ninhos contralaterais se fundem na linha média dorsal formando uma folha confluente17,,18,19,,20.
Este trabalho descreve 1) uma metodologia de dissecção, montagem e imagem ao vivo de longo prazo dos métodos analíticos Drosophila pupae e 2) para estudar a dinâmica da orientação celular e do crescimento em alta resolução espostetorial. Aqui é fornecido um protocolo detalhado, abrangendo todas as etapas necessárias desde a preparação inicial do pupae (ou seja, encenação e imagem) até a extração e quantificação das características de direcionalidade e orientação. Também descrevemos como inferir propriedades de tecidos locais a partir da análise de clones celulares. Todas as etapas descritas são minimamente invasivas e permitem análises ao vivo de longo prazo. Os métodos descritos aqui podem ser facilmente adaptados e aplicados a outros estágios de desenvolvimento, tecidos ou organismos modelo.
A ordem de longo alcance é uma característica essencial da maioria das unidades fisiológicas funcionais. Durante a morfogênese, a ordem é alcançada através da integração de instruções complexas implementadas com alta precisão temporal e espacial. Restrições múltiplas e multinível são integradas em arranjos teciduais estereotipados.
Polaridade e direcionalidade são fundamentais para o arranjo espacial ordenado durante o desenvolvimento. Polaridade implica quebra de simetria du…
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Martín-Blanco por discussões úteis. Agradecemos também a Nic Tapon (The Crick Institute, Londres, Reino Unido), o Bloomington Stock Center (University of Indiana, EUA) e flybase (por anotação genética Drosophila). Federica Mangione foi apoiada por uma bolsa de pré-doutorado da JAE-CSIC. O laboratório Martín-Blanco foi financiado pelo Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P e BFU2017-82876-P) e da Fundação Ramón Areces.
Analysis Software | – | ImageJ | Analyzing data |
Drosophila | Atpa::GFP | – | Strains employed for data collection |
Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | – | Strains employed for data collection |
Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |