Summary
为了了解肿瘤，需要开发在头颈部癌症患者中发生特定基因变异的鼠模型。在这里，我们提出了一个方案，用于使用腺相关病毒-Cas9系统对原性鼠舌细胞进行体外转化，以产生具有特定基因组改变的小鼠HNC细胞系。
Abstract
使用原发正常上皮细胞，利用聚集调控间隔，在肿瘤基因和肿瘤抑制基因中引入特定突变，可以重新诱导细胞转化所需的基因组改变基于小鼠的短音重复（CRISPR）基因组编辑技术。这项技术使我们能够准确地模拟使用小鼠发生的人类癌症的基因变化。通过基因转化鼠原细胞，我们可以更好地研究癌症的发展、进展、治疗和诊断。在这项研究中，我们使用可诱导的Cas9小鼠舌上皮细胞，在体外使用腺相关病毒（AAV）进行基因组编辑。具体来说，通过改变正常舌上皮细胞中的KRAS、p53和APC，在体外产生了一个小鼠头颈部癌（HNC）细胞系，这是合成小鼠的肿瘤。这里介绍的方法详细介绍了如何生成具有特定基因组改变的HNC细胞系，并解释了它们是否适合预测合成小鼠的肿瘤进展。我们设想，这种有前途的方法将是翔实和有用的研究肿瘤生物学和HNC的治疗。
Introduction
HNC是一种常见的恶性肿瘤，全世界1.模拟HNC新奇的起源目前处于一个科学的转折点2。虽然在HNC2、3、4（例如TP53、PIK3CA、NOTCH1、FAT1和RAS）中发现了许多基因突变，但诱导HNC所需的基因组突变的具体组合仍不清楚。
目前人类HNC细胞系的使用大大有助于阐明与发病机制和治疗相关的机制3。然而，研究免疫功能低下的鼠系中的人类细胞系有其局限性，因为这些系统没有解决体内肿瘤过程、特定基因突变的作用以及免疫微环境中的治疗反应。因此，具有特定基因改变的鼠细胞系的发育和建立对于研究不同基因如何促进转化过程以及测试免疫能力小鼠的新型分子疗法至关重要。
生物医学研究中的基因功能研究受到DNA编辑技术的进步的显著影响，例如引入双链断裂（DSBs）。这些技术，包括使用锌指核酸酶、转录活化剂样效应核酸酶和聚类调节间隔短回触性重复（CRISPR/Cas9），允许在其位点操作任何感兴趣的基因。最新的CRISPR/Cas9系统由引导RNA（gRNA）组成，该RNA指示Cas9核酸酶在基因组中的特定位点生成DSB。该系统在修改任何细胞或目标组织的内源性基因方面得到了广泛的认可，即使在最传统的难以治疗的有机体5中也是如此。由于其简单性、速度和效率，它比其他系统具有多种优势。
在肿瘤学领域，CRISPR/CAS9技术满足了有效模仿癌细胞的需求。为了在HNC建立这个系统，我们操纵了有效的KRAS肿瘤基因和两个重要的肿瘤抑制基因，APC和p536。根据GENIE数据库7，这种组合在HNC是罕见的。RAS 突变（HRAS、NRAS 和 KRAS）仅在所有 HNC 人群中存在 +7%。这些肿瘤往往对治疗8，9具有抗药性。
Cas9及其gRNA的传递是通过使用AAV或慢病毒的病毒转导实现的。重组AAV通常是向目标细胞传递基因的首选方法，因为它的度子含量高，免疫反应温和，能够换出广泛的细胞范围，而且整体安全。使用AAV系统，已经生成了各种组织特异性小鼠细胞系，新的细胞系仍在开发中。然而，一个高效的基因组编辑系统，可以产生鼠HNC细胞系模型细胞仍有待开发。在这项研究中，我们寻求开发一种基于体外AAV-Cas9的系统，用于将原生鼠舌细胞转化为肿瘤状态。这种独特的CRISPR/Cas9转化方案和已建立的肿瘤细胞系可用于更好地了解由基因组变化引起的HNC生物学。
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Protocol
这项研究得到了内盖夫动物护理和使用委员会的本古里安大学的批准。动物实验获得IACUC（IL.80-12-2015和IL.29-05-2018（E））的批准。本研究中使用的动物试验、住房和环境条件的所有方面都符合《实验室动物护理和使用指南》13。
1. 阿德诺相关病毒生产
- 第1天：细胞培养
- 种子 4 x 106 HEK293T 细胞每 14.5 厘米板在 15 mL 的 DMEM.准备10个板，用于用聚乙烯酰胺（PEI）转染（1μg/μL）。
- 第2天：使用PEI对HEK293T细胞进行转染
- 在转染前，取下介质，用温暖的 DMEM 1 h 重新进给。
- 预热转染试剂和DMEM。
- 使用10μg的感兴趣质粒含有AAV ITR（AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53-KRAS HDR），10 μg AAV 2/9n 辣椒质粒（带有AAV2代表基因和AAV9的帽基因，每板10微克帮助器质粒（pAdDelta F5帮助器）（参见材料表）。
注：新一代的辅助质粒 - pAdDeltaF614，15，16，也可用于AAV生产。 - 将质粒混合在每盘普通 DMEM 的 1 mL 中。然后加入90μL的聚乙烯胺（总质粒：PEI浓度=1：3）到质粒混合物和涡旋短暂。
- 在室温 （RT） 下孵育 PEI-质粒DNA混合物 20 分钟。
- 在HEK293T细胞顶部滴滴添加混合，在37°C时将板转移到细胞培养箱，5%CO2为24小时。
- 第3天：转染后的中变
- 完全取出介质，并添加 15 mL 的新鲜 DMEM。
- 第5天：收获病毒
- 准备干冰/乙醇浴。
- 用细胞刮刀收集细胞，并将其转移到50 mL管中（每50 mL管2个板）。
- 在室温下，在800 x g下旋转管15分钟。
- 从所有管中丢弃上清液。将每片板的0.5 mL（150 mM NaCl，50 mM Tris-HCl，pH = 8.5）添加到第一管中（即10个板的5 mL）。重新悬浮细胞并将总体积转移到下一个管，并持续到最后一管。
- 将细胞悬浮液转移到新鲜的50 mL管中。使用步骤 1.4.4 中所述的相同传输方法，使用相同体积的莱沙缓冲液（每板 0.5 mL）清洗管。
- 在干冰/乙醇浴和37°C水浴之间，使细胞悬浮液进行三轮约10分钟的冷冻/解冻循环。每次解冻后短暂涡旋。
- 如果在同一天进行纯化，则在 RT 处设置平衡和洗脱缓冲液（有关配方的表 1）。
- 每盘加入50单位的苯甲酸酶，在37°C孵育1.5小时。
注：苯酮酶用于消化宿主产生细胞的残余核酸和细胞悬浮液中的质粒DNA。 - 在 4°C 下以 3，000 x g旋转管 15 分钟。
- 使用 18 G 钢针将上清液收集到注射器中，并将溶液通过 0.45 μm 过滤器推入 15 mL 管中，以获得粗利沙。
- 将粗利酸储存在4°C下数周，直到纯化或继续纯化。
2. AAV纯化
- 第5天或更高版本
- 将平衡和洗脱缓冲液放在 RT 上。
- 用 10 mL 的平衡缓冲液清洗色谱柱。
- 将每盘肝素-阿加柳添加到17列中，然后加入平衡缓冲液（肝素-阿加辛体积的4倍）。通过反转柱并让甘蔗沉淀物混合溶液。
- 通过重力使平衡缓冲器从柱上洗取。
注：留一些平衡缓冲液，以防止角力干燥。 - 将粗利酸盐加载到柱上，在 4°C 下孵育 2 小时，持续搅拌。将柱置于直立位置，让甘蔗进入沉积物。
- 通过重力使粗溶性溶酶。
- 用平衡缓冲液清洗柱（肝素-阿加辛体积的4倍）。
- 将100 kDa离心蛋白过滤器置于柱下方，并使用洗脱缓冲液（肝素-阿加辛的体积的3倍）将病毒排入过滤器中。
注： 洗脱缓冲液不应超过 15 mL。 - 将过滤器在 3，000 x g下离心 30 分钟，直到过滤器中剩余不到 1 mL。
- 用 PBS 和离心机在 3，000 x g下填充过滤器，等待 ±30 分钟，直到过滤器中剩余不到 1 mL。重复此步骤 2x 可去除所有盐分。
- 通过离心在3，000 x g处将病毒溶液浓缩到过滤器中，以达到尽可能小（小于200 μL）的体积。
- 用针头和注射器将病毒溶液吸气，并将溶液通过0.22 μm过滤器推入管中。
- 制作浓缩病毒颗粒的等分物进行储存。
注：等分应为±20μL，用于4°C下短期储存，在-80°C下长期储存±5μL。 - 确定病毒性定子和病毒转导效率，如前所述14，18，19，20。
3. 原细胞的隔离和培养
- 第1天
- 通过CO2窒息或任何其他IACUC批准的协议，将6周大的男性和女性B6;129-Gt（ROSA）26Sortm1（CAG-cas9+，-EGFP）Fezh/J安乐死。
注：这些CRISPR/Cas9敲鼠具有由CAG启动子引导的cas9内分酶和EGFP的Cre重组酶依赖性表达。这些小鼠基因组中存在的上游 Lox-Stop-Lox （LSL） 序列在缺乏 Cre 重组酶的情况下阻止 Cas9 和 EGFP 的表达。当与单导RNA（sgRNA）和Cre源结合使用时，它们允许编辑体内或前体14中的单个或多个小鼠基因。 - 用手术剪刀从安乐死小鼠身上切除舌头。
- 使用手术刀将舌头组织切成非常小的片段，手动分离组织。在含有4.5ml RPMI普通介质（带流出血清）的15 mL管中收集组织片段。
- 将三重酶混合物（200μl）（见食谱表1）添加到组织片段中。
- 在37°C下孵育组织酶混合物30分钟，每10分钟敲打管，增强组织的酶分离。
- 在组织酶混合物中加入含有HBSS/PBS的5%胎儿牛血清（FBS），以阻止酶作用。
- 通过无菌的70μm尼龙网过滤上述细胞悬浮液，以分离分散的细胞和较大的组织碎片。
- 在 RT 的 HBSS/PBS 中，通过离心 300 x g清洗过滤的细胞悬浮液 5 分钟。
- 在培养基培养基中重新悬浮颗粒（RPMI/DMEM中为10%FBS），并在60mm培养皿中生长，直到形成不同的细胞菌落。
- 培养细胞聚集体保留在过滤器顶部，在60毫米培养皿中，含有3 mL的完整介质（RPMI/DMEM中为10%FBS），直到细胞菌落形成。
- 显微检查原细胞在培养1周后是否存在成纤维细胞污染。用0.25胰蛋白酶0.02%EDTA溶液在37°C下处理从聚合和细胞悬浮液中培养的初级细胞，在37°C下1分钟去除成纤维细胞。
注：通常细胞聚集体的主要培养基与单细胞悬浮液相比，会产生更多的菌落。这些菌落的细胞通过AAV转导提供了更好的转导效率。
- 通过CO2窒息或任何其他IACUC批准的协议，将6周大的男性和女性B6;129-Gt（ROSA）26Sortm1（CAG-cas9+，-EGFP）Fezh/J安乐死。
4. 原细胞的AAV转导
- 第10天
- 种子 2 x 105主细胞每孔 6 孔板中，在 2 mL 的完整介质（RPMI/DMEM 中为 10% FBS）。
- 第二天，用10个12个病毒基因组/mL（10个10个转导单元/mL）将细胞转导，并在37°C下在含病毒颗粒的培养基中孵育48小时。
- 去除含病毒颗粒的介质，用完整的介质给AAV转导细胞进料。
注：只有接受转导的细胞才会表达GFP并开始增殖。未进行转导的细胞将在2周内最终死亡。 - 经过2周的培养扩张，将种子细胞进行验证和体内肿瘤实验。
注：从AAV转导细胞和Cas9小鼠的正常原细胞中提取基因组DNA，使用标准协议验证特定的基因组编辑。提取的DNA测序和测序数据（表2）使用基于杂交捕获的下一代测序测定（例如MSK-IMPACT平台）进行，如前21所述。
5. 利用免疫荧光和西印验证正常细胞向肿瘤细胞的转化
- 免疫 荧光
- 种子 2 x 105细胞在 12 毫米玻璃盖上，并把它们放在孵化器中过夜。
- 将细胞固定在PBS中4%的甲醛（pH = 7.4）和免疫荧光标记过程中。
- 在1%BSA或1%血清中，在加湿室中孵育固定细胞，在RT或4°C过夜时1小时。使用的主要抗体是兔单克隆抗KRT 14、兔单克隆抗E-卡塞林抗体和Cas9小鼠mAb。
- 用1x PBS清洗细胞3次，5分钟，从盖玻片中取出原抗体溶液。
- 用Cy3驴抗兔子IgG和/或Cy3山羊抗小鼠IgG二级抗体在PBST中的5%BSA中孵育细胞，在黑暗中RT孵育1小时。
- 如步骤 5.1.4 所述，从盖玻片中取出二级抗体溶液并清洗细胞 3 倍。
- 使用包含 DAPI（DAPI 氟金山）的安装介质滴安装盖玻片。
- 储存在黑暗中 4°C，直到使用荧光显微镜成像幻灯片。
- 西方印迹
- 种子 1 x 106在 100 mm 培养盘中转化细胞，并把它们放在培养箱中过夜。
- 将转化后的细胞洗涤并刮入 200 μl 冰冷 PBS。
- 将含有细胞悬浮液的管在4°C下2，000 x g下离心10分钟，以颗粒细胞。
- 使用含有磷酸酶抑制剂鸡尾酒和蛋白酶抑制剂的酶解液缓冲液（见表1）对上清液和酶分细胞进行10分钟的吸气。C。在10，000 x g和4°C下将莱沙离心10分钟，并收集清除的莱沙。
- 使用市售的布拉德福德测定试剂盒，根据制造商的协议确定蛋白质浓度。使用 4x 样品缓冲液（500 mM Tris pH = 6.8、40% 甘油、8% SDS、20% H2O、0.02% 溴酚蓝色），将蛋白质样品调整到 0.5 或 1 μg/μL。在 96°C 下煮沸 5 分钟。
注：样品可储存在-80°C或直到进行西斑分析。 - 将总赖氨酸（30μg）与10%硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离相等量。确保染料到达凝胶底部。在25V下半干印30分钟，将蛋白质转移到尼龙膜上。
- 将 5% BSA 倒入三层缓冲盐水 （TBS）-0.1% 补间 （TBST） 的膜上，以完全覆盖膜。在RT处将膜块1小时，在4°C过夜时用原抗体（抗Cre、抗Cas9、抗GFP、抗β卡泰宁、抗p53、抗磷-ERK和抗β蛋白稀释）在4°C过夜。
- 孵育后，用1x TBST清洗膜10分钟，确保溶液完全覆盖膜。执行此洗涤 3 倍，然后将马萝卜过氧化物酶 （HRP） 结合二级抗体 （稀释 1：10，000 在 5% BSA TBST） 到膜。在 RT 孵育 1 小时。
- 孵育后，用1x TBST清洗膜10分钟，确保溶液完全覆盖膜。执行化学发光成像（参见材料表）以公开波段，并相应地捕获图像。
- 验证免疫能力小鼠转化细胞的肿瘤生成潜力
注：根据内盖夫本-古里安大学的机构准则维护和治疗小鼠。点头。CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd（NOD.SCID）和C57BL/6小鼠用于体内研究。老鼠被安置在空气过滤的层流柜中，有12小时的明/暗循环，并喂食食物和水。- 使用6-8周大的女性NOD。CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd（NOD.SCID）和C57BL/6小鼠进行研究。
- 胰蛋白化AAV-Cas9转化细胞。在 37°C 下使用 DMEM 预加热停止胰蛋白酶化，并在 50 mL 管中收集。
- 在室温下，在800 x g下将管离心10分钟。无需 FBS，即可丢弃上清液并重新悬浮在 DMEM 培养基中的细胞颗粒。再次执行离心，并在1xPBS中重新悬浮细胞颗粒。
注意：请勿将细胞放在 1x PBS 中时间过长。始终将细胞悬浮液放在冰上，以防止细胞结块。 - 使用自动细胞计数器对细胞进行计数，并使用 1x PBS 将细胞稀释到所需的浓度（2.5 x 107细胞/mL）。通过在每个NOD的右侧侧翼注射AAV-Cas9转化细胞悬浮液，生成肿瘤。CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd（NOD.SCID） 鼠标 （2 x 106细胞/鼠标）。要在合成小鼠中生成正交模型，将0.5 × 106原细胞或AAV-Cas9转化细胞注入C57BL/6免疫功能小鼠的舌头。
- 通过CO2窒息给动物注射后2周安乐死，并解剖安乐死小鼠的肿瘤进行免疫组织化学分析。
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Representative Results
使用 AAV 系统转换正常的 Cas9 单元
图1提供了本研究中使用的AAV转基因质粒的详细矢量图。图 2概述了基于 AAV-Cas9 的系统的设计与工作。为了产生病毒颗粒，使用PEI转染方法用AAV转录载体和其他病毒包装载体转染HEK293T细胞。转染后，对含病毒细胞进行收集和分离，采用肝素-腺素纯化工艺，对病毒颗粒进行纯化和浓缩（图2A）。这些纯化的病毒颗粒用于从Cas9小鼠分离的原细胞的体外转化，以检查其有效性。在我们的系统中，AAV转基因表达盒通过同源重组引入到小鼠细胞内的Cre依赖Cas9 Rosa26靶向模板中，该模板携带无处不在的CAG启动子（pCAG）、LoxP-Stop-LoxP盒（LSL）、Cas9核酸酶基因、自裂P2A肽和报告基因（EGFP），由两个同源臂14。转导细胞的Cre重组酶活性消耗了LSL，并诱导Cas9和GFP表达（图2B）。Cas9核酸酶活性在感兴趣的目标部位引入双链断裂，通过gRNA定向，并帮助进行基因编辑。本研究中使用的AAV系统有助于提供多路复用的gRNA（KRAS、p53和APC的sgRNA），并通过转导细胞的同源定向修复（HDR）表达致癌KRASG12D等位基因。
图1：本研究中使用的AAV转基因质粒的矢量图。此 AAV 系统具有 AAV 主干，可表达 Cre 重组酶和三个 U6 驱动的 sgRNA，以 KRAS、p53 和 APC 为目标。它还包含一个KRAS G12D同源指导修复（HDR）捐赠者。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：AAV-Cas9系统在转换正常细胞中的设计和工作。（A） 用AAV转基因和包装质粒转染后，从HEK293T中生产和纯化AAV颗粒的大纲。（B） 病毒转导原细胞与AAV粒子和机制，通过Cre依赖Cas9表达使CRISPR编辑和原细胞转化为肿瘤细胞。单个 AAV 载体通过 HDR 将三个不同基因的 gRNA 与 KRAS G12D 等位基因的敲撞结合，并带有 Cre 重组酶表达盒，被传送到依赖 Cre 的 Cas9 小鼠主细胞中。转导细胞中的克雷重组酶活性导致LoxP-停止-LoxP盒的切除，并诱导Cas9和GFP表达。请点击此处查看此图的较大版本。
在分离小鼠胚胎成纤维细胞体外验证AAV-Cas9系统
原生小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）细胞已专门用于研究细胞生长和增殖中基因消融的后果22。为了验证AAV-Cas9系统在转化正常细胞方面的效率，我们用AAV转导了从Cas9小鼠胚胎（E14）分离的MEF细胞。MEF细胞被隔离，如前23，24所述。使用14天大的Cas9小鼠胚胎的MEF，因为它们易于在体外培养和转导。简而言之，为了通过AAV转导来转换MEF，在约30%汇合处的初级MEF被认为已做好转导的准备。转导前一小时，MEF 文化介质被更改。纯化的AAV在冰上解冻，MEF培养介质被吸气。病毒上清液与从106-10 10 14病毒基因组/mL不等的牙托被添加到每个井中，并在37°C下孵育过夜。病毒上清液在48小时后被去除，替换为2mL的MEF培养基，然后在37°C孵育，直到GFP表达，转导后约5天。GFP表达的MEF是亚培养和验证的。请注意，对于这个载体，我们发现10个12个病毒基因组/mL（相当于10个10个转导单元/mL）可以有效地将原代MEF细胞转化为肿瘤MEF（图3A）。转导细胞表达Cre、Cas9和GFP（图3B，C）。为了获得AAV转化MEF细胞的肿瘤电位，在NOD-SCID小鼠中注射了0.5 x 106细胞（原发/AAV转导MEF）。与原发MEF相比，转化的细胞在这些小鼠中形成肿瘤，而原发性MEF没有形成肿瘤（图3D-F）。
图3：使用AAV-Cas9系统对原体MEF细胞进行验证和体外转化。（A） 使用AAV粒子从Cas9小鼠收集的胚胎中成纤维细胞体外转化的轮廓。（B） 初级MEF和AAV转导MEF细胞的代表性免疫荧光图像，显示GFP、Cre和Cas9的表达。DAPI被用来染色核。（C） 西方印迹在胚胎正常成纤维细胞和基因编辑的成纤维细胞中显示Cre、Cas9、GFP和β-actin。（D） 用转化的成纤维细胞注射后在NOD-SCID小鼠中发育的舌肿瘤的代表性图像。（E） 在用转化的成纤维细胞注射后在NOD-SCID小鼠中形成的唇肿瘤的代表性图像。（F） 在NOD-SCID小鼠中注入转化成纤维细胞后，在侧翼肿瘤中发育的侧翼肿瘤的代表性图像。箭头表示肿瘤。请点击此处查看此图的较大版本。
使用AAV-Cas9系统从原舌上皮细胞体外生成肿瘤小鼠舌上皮细胞系
使用MEF细胞验证AAV系统的转化特性后，我们从Cas9小鼠中分离出原味上皮细胞，并在体外培养它们。主舌细胞用AAV病毒颗粒（1010 cfu/mL）转导，一周后细胞开始表达GFP。使用免疫荧光和西印，证实了原发性舌上皮细胞的肿瘤转化（图4A）。转化后的细胞表现出增强的KRT 14、E-cadherin和GFP表达（图4B）。原发性舌上皮细胞的肿瘤转化通过GFP的表达（即Cas9和GFP的依合表达）得到确认（图4C）。KRT14和E-cadherin的表达证实了它们的上皮细胞特征。蛋白质验证确认增强的β-卡腾宁，磷-ERK，并减少p53表达（图4C），表明APC和p53的有效降压和突变KRAS的加入舌细胞，从而使它们呈肿瘤。通过从转化细胞中分离出的DNA进行深度测序进行基因组分析，证实了AAV-Cas9系统对TP53和APC基因的有效基因编辑和帧移位（表2）。通过将AAV转化舌细胞系的肿瘤性进一步评估，将其注射到免疫能力野生型C57BL/6小鼠的舌头中。转化的舌细胞，被指定为KRAS突变的舌头上皮细胞（KRAS Mut EpT），在C57BL/6小鼠中有效形成肿瘤（图4D）。KRAS Mut EpT 肿瘤由口腔和颌面病理学家通过常规血氧林和欧辛 （H&E） 染色和免疫组织化学进行评估。肿瘤表现出主轴细胞形态，具有突出的核视点：胸膜、高色度、巨核、几核、高线粒率和非典型线粒体。还注意到血管外入侵和血管入侵。这些形态特征伴随着非常有限的肿瘤相关炎症。在免疫组织化学上，肿瘤细胞对E-cadherin和KRT 14的细胞质呈阳性，这两种标记物都是上皮组织的标记物。KRT 14是典型的鳞状上皮，支持肿瘤细胞的鳞状起源，从而诊断鳞状细胞癌（图4E）。因此，这种方法提供了一个通用的方法，在体外转换原细胞与所需的基因改变。此外，该方法有助于在合成小鼠体内使用这些发达的细胞系，以更好地了解真实肿瘤微环境中的肿瘤。
图4：使用AAV-Cas9系统对原舌上皮细胞进行体外转化。（A） 从Cas9小鼠的舌头获得的正常上皮细胞体外转化的原理表示。（B） AAV转导舌上皮细胞的代表性免疫荧光图像，显示KRT14、E-cadherin和GFP的表达。（C） 西印体显示 Cas9、 β-卡坦宁和磷-ERK 向上调节与 p53 蛋白质水平下降调节， 显示基因编辑的上皮细胞.（D） 在用转化的舌上皮细胞（KRAS Mut EpT）注射后在免疫能力小鼠的舌头上发育的肿瘤的代表性图像。（E） H&E、E-cadherin 和 KRT 14 的肿瘤组织部分的代表性图像，放大倍数为 20 倍和 40 倍。请点击此处查看此图的较大版本。
| 用于病毒采集的细胞莱沙缓冲液 | 体积 |
| 150 mM 纳Cl | 876.6毫克 |
| 50 mM Tris-HCl | 605.7毫克 |
| 使用 HCl 调节 pH 8.5 | |
| 分子级水 | 高达 100 mL |
| 平衡缓冲器 | |
| 1 mM MgCl2 | 9.52毫克 |
| 2.5 mM KCl | 18.64毫克 |
| 全部混合在 PBS 1X 中，并将 pH 调整到 7.2 | 高达 100 mL |
| 洗脱缓冲液 | |
| 0.5 M 纳Cl | 2.92克 |
| 全部混合在 PBS 1X 中，并将 pH 调整到 7.2 | 高达 100 mL |
| 10X 三重酶库存解决方案： | |
| 胶原 酶 | 1 克最终康康 [10 毫克/毫升] |
| 透明 质 酸 酶 | 100毫克 [1毫克/毫升] |
| 德纳塞 | 20，000 单位最终康定 [200 毫克/毫升] |
| PBS 1X | 高达 100 mL |
| 质粒混合（用于一个 14.5 厘米板） | |
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR | 10μg |
| AAV 2/9 帽状矢量 | 10μg |
| pAD 增量 F5 帮助器 | 10μg |
| PEI （1μg/μl 库存） | 90μl |
| DMEM | 1 mL |
表1：本研究中使用的缓冲器配方。
表2：克拉斯穆特EpT细胞的基因组分析数据。请点击此处查看此表（右键单击下载）。
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Discussion
以前已经使用几种方法来转化培养中具有可变成功率的初级细胞25，26，27，28。这些方法大多使用小鼠成纤维细胞进行转化14、17、18、19或使用致癌物质，如4-硝基基苯丙胺-1-氧化物（4-NQO）21，22用于开发鼠细胞系模型。 使用挖空和转基因小鼠模型也大大增强了我们对控制HNC发展和分化的各种分子途径的理解。使用具有独特遗传模式的鼠口服上皮细胞系肯定会补充这些研究，其随后的生化测定将有助于HNC的治疗和诊断。然而，只有少数报告描述了小鼠口服上皮细胞的建立28，29，30，31，32，33和这些细胞系没有广泛使用。
这些鼠口服上皮细胞系的主要局限性是，它们在分子水平上没有广泛的特征，并且被发现表达不寻常的基因模式。因此，对这些鼠细胞系模型的分子理解有限，缺乏有效的方法，促使我们利用Cas9敲鼠中AAV-CRISPR基因组编辑技术的独特潜力，建立与特定基因改变。在这项研究中，我们介绍并开发了一种体外AAV-Cas9系统，用于将原生鼠细胞转化为肿瘤状态，以确认引起癌细胞的基因改变。利用AAV介导CRISPR诱导的体细胞，通过多个sgRNA组合，成功地建立了具有特定基因突变的鼠舌上皮细胞。
该方法为更好地了解HNC细胞自主病因提供了一种新的实验方法。从鼠原舌上皮细胞开始，我们通过删除一组有限的基因并引入单个KRAS突变，将此类细胞转化为肿瘤原性。使用这种方法，现在可以调查其他已知与其他癌相关的其他基因是否可能产生更类似于HNC的恶性肿瘤。KRAS Mut EpT肿瘤的形态特征证实了鳞状细胞癌。合成小鼠KRAS Mut EpT肿瘤的组织病理学分析与头颈癌的侵略性生物学行为相关和支持。因此，有可能将癌细胞的基因型与肿瘤的特定临床特征和组织病理学特征联系起来。
该方法的主要优点是能够利用特定基因突变从任何器官的初级细胞中开发细胞系，并使用AAV-Cas9，使系统更加坚固和稳定。内源性Cas9系统使得利用其他基因敲除成为可能。目前方法的主要缺点是分离和建立原始培养物所需的时间，以及转导原细胞所需的病毒颗粒的高度度。但是，可以通过标准化每种单元类型的隔离过程来克服这一点。需要高AAV病毒定度才能进行高效转导的问题可以通过使用最新一代的辣椒和帮助剂质粒进行病毒包装和更好的纯化过程来缓解。
将来，可以设计一个更好、更高效的AAV系统，在体内进行外推，以制造器官特异性转基因肿瘤模型。总之，用这种方法建立鼠细胞系将作为一种宝贵的体外细胞培养工具，在肿瘤学背景下测试几种假设。
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Disclosures
M.S.是生物科学研究所咨询委员会的成员，美纳里尼·赖斯切从美洲狮生物技术公司、第一-三科、塔格免疫学、免疫医学和美纳里尼水稻学获得研究资金。M.S. 也是梅门迪医疗旅行的联合创始人，在过去两年中，他获得了美纳里尼·里斯切和ADC制药公司的酬金。所有其他作者都没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢丹尼尔·吉特勒博士为我们提供了pAd Delta 5帮手质粒。这项工作由以色列科学基金会（ISF，700/16）（致ME）、美国-以色列两国科学基金会（BSF，2017323）（对ME和MS）、以色列癌症协会（ICA，20170024）（对ME）、以色列癌症研究基金会（ICRF，17-1693-RCDA）（对ME）和关注基金会（#7895）资助。研究金：阿隆奖学金，ME和BGU克雷特曼奖学金给SJ和MP。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin - Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzymes | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Glass wares | |||
| Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slides | Bar Naor | BN9308C | |
| Mouse strains | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
| AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Plastic wares | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Culture plates | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tubes | Greiner Bio-One |
References
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