Method Article

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

DOI:

10.3791/60410

⸱

January 9th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1The Shraga Segal Department of Microbiology, Immunology and Genetics, Ben-Gurion University of the Negev, 2Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 3Human Oncology & Pathogenesis Program (HOPP), Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Institute of Pathology, Barzilai University Medical Center

In This Article

Summary

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Le développement de modèles murins avec des gènes spécifiques mutés dans les patients atteints de cancer de la tête et du cou est nécessaire pour la compréhension de la néoplasie. Ici, nous présentons un protocole pour la transformation in vitro des cellules primaires de langue murine utilisant un système adeno-associé de virus-Cas9 pour produire des lignes de cellules murines de HNC avec des altérations génomiques spécifiques.

Abstract

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L'utilisation de cellules épithéliales normales primaires permet d'induire de façon reproductible les altérations génomiques nécessaires à la transformation cellulaire en introduisant des mutations spécifiques dans les oncogènes et les gènes suppresseurs de tumeurs, en utilisant des courte répétition palindromic (CRISPR) à base de technologie d'édition du génome chez la souris. Cette technologie nous permet d'imiter avec précision les changements génétiques qui se produisent dans les cancers humains à l'aide de souris. En transformant génétiquement les cellules primaires murines, nous pouvons mieux étudier le développement, la progression, le traitement et le diagnostic du cancer. Dans cette étude, nous avons utilisé des cellules épithéliales de langue de souris Cas9 cre-inductibles pour permettre l'édition de génome utilisant le virus adéno-associé (AAV) in vitro. Plus précisément, en modifiant KRAS, p53, et APC dans les cellules épithéliales normales de langue, nous avons produit une ligne de cellules de tête et de cou murine (HNC) in vitro, qui est tumorigenic dans les souris syngeneic. La méthode présentée ici décrit en détail comment générer des lignées cellulaires HNC avec des altérations génomiques spécifiques et explique leur pertinence pour prédire la progression tumorale chez les souris syngénéiques. Nous envisageons que cette méthode prometteuse sera instructive et utile pour étudier la biologie et la thérapie de tumeur de HNC.

Introduction

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HNC est une malignité commune dans le monde1. La modélisation de la genèse de la néoplasie HNC est actuellement à un tournant scientifique2. Bien que de nombreuses mutations génétiques aient été identifiées dans HNC2,3,4 (p. ex., TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 et RAS), les combinaisons spécifiques d'altérations génomiques requises de concert pour induire hNC demeurent floues.

L'utilisation actuelle des lignées cellulaires humaines hNC a contribué de manière significative à élucider les mécanismes associés....

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Protocol

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Cette étude a été approuvée par l'Université Ben Gourion du Comité de soins et d'utilisation des animaux du Néguev. Les expériences sur les animaux ont été approuvées par l'IACUC (IL.80-12-2015 et IL.29-05-2018(E)). Tous les aspects de l'expérimentation animale, du logement et des conditions environnementales utilisés dans la présente étude étaient conformes au Guide pour l'entretien et l'utilisation des animaux de laboratoire13.

1. Production de virus associée à l'adéno

  1. Jour 1: Culture cellulaire
    1. Graine 4 x 106 cellules HEK293T par plaque de 14,5 cm dans 15 ml de DMEM. Préparer 10 plaque....

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Results

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Utilisation du système AAV pour transformer les cellules Cas9 normales
La figure 1 fournit une carte vectorielle détaillée du plasmide transgénique AAV utilisé dans cette étude. La figure 2 décrit la conception et le fonctionnement du système à base d'AAV-Cas9. Pour produire des particules virales, les cellules HEK293T ont été transfectées avec le vecteur transgénique AAV et d'autres vecteurs d'emballage viral.......

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Discussion

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Plusieurs méthodes ont déjà été utilisées pour transformer les cellules primaires en culture avec des degrés variables de succès25,26,27,28. La plupart de ces méthodes utilisent des cellules de fibroblaste de souris pour la transformation14,17,18,19 ou utilisent des c.......

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Disclosures

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M.S. est membre du conseil consultatif de l'Institut des sciences biologiques, et Menarini Ricerche a reçu des fonds de recherche de Puma Biotechnology, Daiichi-Sankio, Targimmune, Immunomedics et Menarini Ricerche. M.S. est également co-fondateur de Medendi Medical Travel, et au cours des 2 dernières années, a reçu des honoraires de Menarini Ricerche et ADC Pharma. Tous les autres auteurs n'ont rien à divulguer.

Acknowledgements

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Nous tenons à remercier le Dr Daniel Gitler de nous avoir fourni le plasmide de la plasmide de la plasmide de la plasmide delta 5. Ces travaux ont été financés par l'Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (à ME), la United States-Israel Binational Science Foundation (BSF, 2017323) (à ME et MS), l'Israel Cancer Association (ICA, 20170024) (à ME), l'Israel Cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (à ME), et la Concern Foundation (#7895) (à ME). Bourse : bourse Alon à ME et BGU Kreitman fellowships à SJ et MP.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anticorps >
anti-souris HRPJackson ImmunoResearch115-035-146
Anti lapin HRPJackson ImmunoResearch711-035-152
Cas9 Mouse mAbCell Signaling Technology14697
CreBioLegend900901
Cy3-AffiniPure IgG anti-souris pour chèvreJackson ImmunoResearch115-165-062
Cy-AffiniPure IgG anti-lapin JacksonImmunoResearch111-165-144
GFPSanta Cruz Biotechnologysc-9996
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)Technologie de signalisation cellulaire4370
signalisationcellulaire monoclonale anti E cadhérine pour lapin3195S
Lapin monoclonal anti-KRT 14AbcamAB-ab181595
&beta ; actineMP Biomedicals691001
&beta ; caténineTechnologie de signalisation cellulaire9582S
Cell lines
HEK93TATCCCRL-3216
Milieux de culture, produits chimiques et réactifs
Bradford ReagentBio-Rad30015484
BSAAmresco0332-TAM-50G
DAPI fluoromountSouthern Biotech0100-20
DMEMBiological Industries Israël Beit-Haemek Ltd.01-055-1A
ECL (Westar Supernova et Westar Nova 2.0)CyanagenXLS3.0100 et XLS071.0250
FBSBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.04-127-1A
HBSSSigmaH6648
Héparine - AgaroseSigmaH6508
Isolat II Kit d’ADN génomiqueBiolineBIO-52066
MgCl2Panreac AppliChem300283
NaClBio Lab Ltd1903059100
PBSBiological Industries Israël Beit-Haemek Ltd.02-023-1A
PEIPolysciences23966-1
Stylo Solution de streptocoqueBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.03-031-1B
PFASanta Cruz Biotechnology30525-89-4
Cocktail d’inhibiteurs de la phosphataseBiotoolB15001A/B
Cocktail d’inhibiteurs de protéaseMilliporeSigmaP2714-1BTL
Tampon TrisMERCK Millipore648311-1KG
strong>Enzymes
BenzonaseSigmaE1014
Collagénase IVThermo Fisher Scientific17104019
DNAseThermo Fisher Scientific18047019
HyaluronidaseMilliporeSigmaH3506
TrypsineBiological Industries Israël Beit-Haemek Ltd.03-050-1B
Verreries
CouverclesBar NaorBNCB00130RA1
SlidesBar NaorBN9308C
Souches de souris
C57BL/6Envigo
B6 ; 129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/JJackson labs24857
NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)Envigo
Plasmides
AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDRBroad Institute of MITDon aimable du Dr Randall J Platt et du Dr Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT et Harvard, Cambridge, MA 02142, USA
AAV 2/9 vecteur de capsideAddgene112865
pAD Delta F5 helperUniversité Ben Gourion du NéguevFourni par le Dr Daniel Gitler, Département de physiologie et de biologie cellulaire, Faculté des sciences de la santé, et Centre Zlotowski pour les neurosciences, Université Ben-Gourion du Néguev, Beer-Sheva 84105, Israël.
Plastic wares
Amicon-ULTRA filter 100 KDaMilliporeUFC910024
0.22 µ ; filtres stériles m, 4 mmMillexSLGV004SL
0,45 & micro ; Filtres stériles, 13 mmMillexSLHV013SL
Plaques de cultureGreiner Bio-One
Tubes FalconGreiner Bio-One
Technologie de <

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789(2018).
  2. Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A.

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Head Neck CancerCRISPR Cas9AAV TransductionPrimary Cell CultureTongue Epithelial CellsGene EditingTumorigenic TransformationSyngeneic MiceImmunofluorescence AnalysisWestern Blotting

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