Aumentare la durabilità delle colture di cellule neurali dissociate utilizzando la matrice corallina biologicamente attiva
Summary
La coltura cellulare ippocampale dissociata è uno strumento sperimentale fondamentale nelle neuroscienze. La sopravvivenza e la funzione delle cellule neurali in coltura sono migliorate quando gli scheletri corallini sono usati come matrici, a causa dei loro ruoli neuroprotettivi e neuromodulativi. Quindi, le cellule neurali cresciute sulla matrice corallina mostrano una maggiore durata e quindi sono più adeguate per la coltivazione.
Abstract
Le colture di cellule neuronali e gliali dissociate dell’ippocampo sono un prezioso modello sperimentale per studiare la crescita e la funzione neurale fornendo un elevato isolamento cellulare e un ambiente controllato. Tuttavia, la sopravvivenza delle cellule ippocampali in vitro è compromessa: la maggior parte delle cellule muore durante la prima settimana di coltura. È quindi di grande importanza identificare modi per aumentare la durata delle cellule neurali in coltura.
Il carbonato di calcio sotto forma di aragonite cristallina derivata dallo scheletro dei coralli può essere utilizzato come matrice attiva superiore per colture neurali. Nutrendo, proteggendo e attivando le cellule gliali, lo scheletro di corallo migliora la sopravvivenza e la crescita di queste cellule in vitro meglio di altre matrici.
Questo protocollo descrive un metodo per coltivare cellule ippocampali su una matrice corallina. Questa matrice viene generata attaccando granelli di scheletri di corallo a piatti di coltura, fiaschi e vetrine. I grani aiutano a migliorare l’ambiente delle cellule introducendole in un ambiente tridimensionale (3D) per crescere e formare strutture simili ai tessuti. L’ambiente 3D introdotto dallo scheletro di corallo può essere ottimizzato per le cellule mediante macinazione, che consente il controllo sulla dimensione e la densità dei grani (cioè la rugosità della matrice), una proprietà che è stata trovata per influenzare l’attività delle cellule gliali. Inoltre, l’uso dei grani facilita l’osservazione e l’analisi delle colture, soprattutto quando si utilizza la microscopia ottica. Quindi, il protocollo include procedure per la generazione e l’ottimizzazione della matrice corallina come strumento per migliorare il mantenimento e la funzionalità delle cellule neurali in vitro.
Introduction
Le colture di cellule neurali dissociate, in questo caso cellule ippocampali, sono un valido modello sperimentale per studiare la crescita e la funzione neurale fornendo un elevato isolamento cellulare e accessibilità 1,2,3. Questo tipo di coltura è frequentemente utilizzato nelle neuroscienze, nello sviluppo di farmaci e nell’ingegneria tissutale a causa della grande quantità di informazioni che possono essere raccolte, come tassi di crescita e vitalità, neurotossicità, crescita e networking dei neuriti, connettività sinaptica e plasticità, modifiche morfologiche, organizzazione e cablaggio dei neuriti, ecc.1,4,5,6,7.
Nonostante l’importanza delle colture, le cellule coltivate sono solitamente costrette a crescere su vetrini in un monostrato bidimensionale. Queste rigide modifiche ambientali riducono significativamente la capacità delle cellule neurali di sopravvivere nel tempo, perché i vetrini di copertura sono substrati non nutritivi con una bassa forza di adesione, esibendo una minore capacità di sostenere la crescita cellulare 8,9,10,11.
Poiché le cellule neurali coltivate sono costrette a crescere in condizioni difficili, un approccio essenziale per migliorare la loro sopravvivenza sarebbe quello di imitare il loro ambiente naturale il più possibile12,13. Ciò potrebbe essere ottenuto utilizzando biomateriali che agiranno come matrici e imiteranno la matrice extracellulare delle cellule, consentendo loro di formare una struttura simile a un tessuto e assistere nel loro nutrimento14.
L’uso di biomateriali è un approccio promettente per migliorare le colture cellulari, perché agiscono come scaffold biocompatibili, fornendo stabilità meccanica e migliorando una varietà di proprietà cellulari, tra cui adesione, sopravvivenza, proliferazione, migrazione, morfogenesi e differenziazione15,16,17. Diversi tipi di biomateriali sono utilizzati per migliorare le condizioni delle cellule in vitro. Tra questi ci sono i biopolimeri o componenti biologici che di solito fanno parte della matrice extracellulare delle cellule. Questi biomateriali sono utilizzati principalmente come forma di agenti di rivestimento polimerizzati o idrogel18,19,20. Da un lato, le matrici sopra menzionate danno alle cellule un ambiente 3D familiare in cui crescere, incoraggiano la loro adesione al piatto e danno loro supporto meccanico21,22. D’altra parte, la loro forma polimerizzata e il confinamento delle cellule all’interno degli idrogel disturba l’accesso delle cellule ai componenti nutritivi presenti nei mezzi di crescita e rende anche più difficile il follow-up delle cellule con metodi microscopici23.
Gli esoscheletri corallini sono matrici biologiche di origine marina. Sono fatti di carbonato di calcio, hanno stabilità meccanica e sono biodegradabili. Studi precedenti che utilizzavano lo scheletro di corallo come matrice per la crescita di cellule neurali in coltura hanno mostrato un’adesione molto maggiore, rispetto ai vetrini24,25. Inoltre, le cellule neurali cresciute sullo scheletro di corallo hanno dimostrato la loro capacità di assumere il calcio di cui è composto lo scheletro, che protegge le cellule neurali in condizioni di privazione di nutrienti26. Inoltre, lo scheletro di corallo è una matrice di supporto e nutrimento che aumenta la sopravvivenza delle cellule neurali, incoraggia la formazione di reti neurali, eleva il tasso di connettività sinaptica e consente la formazione di strutture simili a tessuti27,28. Recenti studi hanno anche dimostrato che la topografia superficiale della matrice dello scheletro di corallo gioca un ruolo cruciale nella distribuzione e nell’attivazione delle cellule gliali 8,29. Inoltre, lo scheletro di corallo è efficace come matrice per la coltivazione di altri tipi cellulari, come gli osteociti30,31, gli epatociti e i cardiomiociti in coltura (dati non pubblicati).
Quindi, lo scheletro di corallo è una matrice promettente per la coltivazione di cellule in vitro. Pertanto, il protocollo descritto di seguito descrive la tecnica di coltivazione di cellule neurali su scheletro di corallo per produrre colture neurali più stabili e prospere di quelle ottenute con i metodi esistenti. Questo protocollo può anche essere utile per la coltivazione di cardiomiociti, epatociti e altri tipi di cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnica qui presentata descrive un modo per migliorare il mantenimento e la funzionalità delle cellule neurali in coltura. Ciò si ottiene facendo aderire le cellule a una matrice fatta di grani di scheletro di corallo che nutre le cellule e ne promuove la crescita e l’attività. L’uso di questa tecnica aumenta la capacità del modello di coltura neurale di imitare l’ambiente delle cellule nel cervello.
L’introduzione della matrice come substrato di coltura presenta diversi vantaggi rispet…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal programma KAMIN del Ministero del Commercio e del Lavoro israeliano e da Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, Stati Uniti.
Materials
| 24-well plates | Greiner | #60-662160 | |
| B-27 | Gibco | #17504-044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | #A4503 | |
| D – glucose | Sigma | #G8769 | |
| Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM) | Sigma | #D5796 | |
| Electrical sieve | Ari Levy | #3700 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Biological Industries | #04-007-1A | |
| First Day Medium | 85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose. | ||
| Flasks | Greiner | #60-690160 | 25cm^2, Tissue culture treated |
| Fluoro-deoxy-uridine | Sigma | #F0503 | |
| Glass Coverslips | Menzel-Glaser | #BNCB00120RA1 | |
| H2O2 | Romical | #007130-72-19 | Hazardous |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Sigma | #N4888 | |
| HANK'S solution | Sigma | #H6648 | |
| Kynurenic acid | Sigma | #K3375 | |
| L – glutamine | Sigma | #G7513 | |
| Manual strainer (40µm) | VWR | #10199-654 | |
| Minimun Essential Eagle (MEM) | Sigma | #M2279 | |
| Mortar and pestle | De-Groot | 4-P090 | |
| NaClO (Sodium Hypochlorite) | Sigma | #425044 | Hazardous |
| NaOH | Sigma | #S8045 | Hazardous |
| Neuronal Growth Medium | 45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine. | ||
| Petri dish | Greiner | #60-628160, #60-627160 | 60mm, 35mm, respectively. |
| Poly D – Lysine | Sigma | #P7280 | |
| Smart Dentin Grinder | KometaBio | #GR101 | |
| Trypsin | Gibco | #15-090-046 | |
| Uridine | Sigma | #U3750 |
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